Пропионат метан курс: Курс метан и тестостерон пропионат курс

Содержание

✅ тестостерон и винстрол курс

✅ тестостерон и винстрол курс

Отзывы тестостерон и винстрол курс

Материал плотный, я обычно приклеиваю пластырь на плечо, уже привык. Следов после применения не остается, никаких покраснений и отпечатков, болезненных ощущений во время использования не возникает. Первое время скачки тестостерона были очень ощутимые — буквально через час возникало возбуждение, появлялась эрекция. Конечно, целый день такие изменения не сохранялись, зато из ниоткуда бралась энергия на спорт и работу, на корню исчезала апатия с постоянной сонливостью. После 3-х пластырей тестостерон полностью пришел в норму. Хотя после этого эффект уже не был настолько ощутимым, но именно пластырь помогал восстановить сексуальную жизнь и продлить время полового акта, без Тестонормина секс становился скучным и не особо продолжительным. Отзывы о тестостерон и винстрол курс

Реальные отзывы о тестостерон и винстрол курс.

Где купить-тестостерон и винстрол курс

тестостерон курс приема повышенный тестостерон у мужчин форум тестостероновый пластырь купит в Копейске Не знаю, сколько нужно пластырей, чтобы добиться абсолютного восстановления уровня тестостерона, но в качестве возбудителя Тестонормин мне пригодился. Действует он быстро, но не резко. Пластырь улучшает кровообращение в паху, это было ощутимо. Эмоции во время полового акта стали более яркими, я самостоятельно стал контролировать продолжительность процесса. Такой результат очень понравился моей девушке, она меня таким страстным давно не видела) Хотя пару раз из-за пластыря была бессонница, но это только в первые дни.
Где в Воронеже купить TestonorminЯ применял курсом для улучшения общего состояния с помощью Тестонормина. Берется пластырь, клеится на торс под одежду. Я наклеивал на предплечье, где он не был виден окружающим и не цеплялся за ремень, лямку сумки. Носил по 24 часа.

Понравились тестостероновые пластыри. Особых проблем в сексе не было, но решил усилить ощущения. Они действительно усилились, стал ощущать себя настоящим мачо, секс стал более грубым, но доставляющим и мне, и партнерше больше удовольствия. Плюс увеличилась продолжительность секса. Могу заниматься полчаса, не кончая и никак себя не контролируя. Партнерша без ума от этих пластырей, как и я. Думаю, буду использовать их частенько. Ведь тестостерон полезен для мужчин. То есть, это средство и приятное, и полезное, что редкость. Сами пластыри сделаны качественно, надежно закрепляются, в них можно даже в ванной заниматься сексом 🙂

Ещё где посмотреть тестостерон и винстрол курс: Производитель указывает, что пока не может рассекретить инновационную формулу. Причина заключается в банальном опасении, что состав стащат конкуренты. Пока что состав защищается законодательством о коммерческой тайне. У 99% пациентов восстановились обменные процессы (как общие, так и локальные). 95% больных отметили повышение качества жизни, появление энергии и сил. Это еще раз подтверждает тот факт, что Тестонормин – это не развод, не обман и не мошенничество. тестостерон инструкция. повышенный тестостерон у женщин причины симптомы. тестостерон и прыщи. какие продукты повышают тестостерон у мужчин список
Специалисты говорят о разных причинах, которые могут вызвать нарушения эректильной функции. Когда у вас не получилось один-два раза, ничего страшного. Когда осечки становятся регулярными, нужно что-то делать. Но перед началом лечения придется понять причину проблем. В реальных отзывах о средстве Testonormin для повышения эрекции многие пишут, что препарат подарил им возможность вновь ощутить себя настоящим мужчиной. Причём его положительное влияние они смогли ощутить уже после первого-второго применения. Секрет такой результативности заключается в том, что средство содержит чистый тестостерон. Он быстро проникает через барьер из кожи и соединительной ткани, и попадает прямо в кровь. Это помогает веществу усвоиться намного быстрее, чем, если бы принимать его традиционным пероральным способом. При этом препарат стимулирует процессы в организме, ответственные за производство естественного тестостерона Подобное воздействие обеспечивает нормализацию функций половой сферы и избавляет от всех нарушений потенции. ярина при повышенном тестостеронетестостерон и винстрол курс
для повышения тестостерона у мужчин в аптеке, для повышения тестостерона у мужчин в аптеке
тестостерон и винстрол курс,тестостерон курс приема, тестостероновый пластырь купит в Чите
Где в Воронеже купить Testonormin.

Предложенный курс Винстрол + Тестостерон Пропионат пользуется весьма хорошим спросом среди спортсменовлюбителей. Винстрол – препарат на водной основе, на курс нам понадобиться 2 флакона по 10 мл. каждый. №4. Курс тестостерона пропионата и винстрола (станозолола). Данное комбинирование препаратов можно использовать как. тестостерон пропионат – 1800мг (если в одной ампуле 100мг, то на курс нужно – 18 ампул). винстрол – 177шт. 1 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница. В магазине стероидов Mensgen курс винстрол + тестостерон пропионат по лучшей цене. Схема приема и консультации бесплатно. Доставка по РФ. Проведение Тестостерон Винстрол курса можно рекомендовать спортсменам, желающим быстро привести свое тело в порядок после использования мощных массонаборных ААС. Это одна из основных целей данного сочетания ААС, но далеко не единственная. Также атлеты могут набрать несколько кило. Курс винстрол тестостерон пропионат. Преимущества пропионата. Только тот факт, что пропионат часто используется. Винстрол – в течении всего 8 недельного курса, мы будем использовать так же 2 флакона по 10 мл, общий объем 20 мл. Препарат вводится точно так же, строго в ягодичную мышцу 2 раза. Тестостерон и винстрол. Страница 1 из 2. Винстрол очень побочный преп и не для новичка. Я бы его юзал в конце жесткого курса. Но раз вопрос из двух препаратов, то есть несколько вариантов. Станозолол (альтернативное название — Винстрол) относится к группе стероидовпроизводных дегидротестостерона. Курс тестостерона: Пропионат и Станозолол. Он помогает устранить излишний вывод жидкости, защищая сухожилия и связки. Длительность приема составляет 5–8 недель. Дозировка в сутки. Диета и тренировки во время сушки. Сильнейший антикатаболик, сжигатель жира — аминокислота добавка ВСАА. На сушке ее нужно принимать до тренинга, после него и в перерывах между приёмами пищи. Использование совместного курса станозолола + тестостерона пропионата является очень эффективным для получения следующих результатов. Курс инъекционного и орального Винстрола Станозолол, еще известный как Винстрол, является востребованным в спортивном мире допинговым Подробнее→. Курс для сушки: тестостерона пропионата и станозолол (винстрол). Тестостерон пропионат курс для новичка. Данный курс идеально подойдет для начинающих спортсменов.

Официальный сайт тестостерон и винстрол курс

Метан — это оральный стероид, характеризующийся большой анаболической активностью. А энантат — препарат тестостерона, который дает сильный андрогенный эффект. В данной статье рассмотрим характеристики. Сколько можно набрать с курса тестостерона пропионата и метана? Не знаешь? А мы знаем! Специально для тебя составили схему приема, рассказали о пкт, ценах. Тестостерон энантат – что это? Курс тестостерона энантата!. №3. Курс тестостерона энантата и метана. Такое сочетание данных стероидных препаратов позволит вам очень хорошо спрогрессировать в плане набора. Купить готовый курс на массу нандролон (дека), тестостерон энантат и метан по низкой цене. Быстрая доставка почтой в Россию. Отзывы и рекомендации по ПКТ. В магазине стероидов Mensgen курс Тестостерон пропионат + Метан + ПКТ. Схема приема и консультации бесплатно. Скидки. Доставка по РФ. Что такое тестостерон пропионат? Это раствор масляной консистенции со специфическим запахом, в составе которого преобладает высокая концентрация тестостерона. Вспомогательным синтетическим компонентом. Курсить метаном, туринаболом, оксандролоном, провироном и любыми. Низкий тестостерон это не только снижения либидо и ухудшение потенции (хер с ними, настоящие труЪкачки не парятся про письки), это крайне вредно. По своему строению метан очень схож с тестостероном и его аналогами. Он обладает такой же анаболической и меньшей андрогенной активностью, и крайне плохо стабилизирует андрогенные рецепторы, тем не менее это легко. Курс тестостерон энантат и метан вы можете купить у нас в магазине. Отличная комбинация для набора силы и массы. Подробное описание отзывы и составление.

#1 Курс на массу новичку

Курс на массу для новичка — Описание и применение

Если Вы ищете качественный курс на массу для начинающего , для того что бы успеть все же набрать заветные  первые 8-10 кг   массы, этот курс лучшее что можно предложить на первых этапах знакомства со стероидами !

Курс метан  и тестостерона пропионат 

Составив данный курс, мы учитывали самые основные потребности наших клиентов, а именно этот курс:

  1. Не дорогой курс на  массу;
  2. Курс не имеющий тяжелые побочные эффекты
  3. Не приводит к  высокому набору  воды и жировой массы;
  4. Курс подойдет как для новичка так и для опытного атлета, он универсален;

Основным препаратом в данном курсе является Тестостерона Пропионат , это базовый препарат дающий прирост массы за счет своей анаболической и андрогенной активности. 

Метан  в данном курсе включен как дополнительный препарат, так как не так курс будет не таким долгим, он повысит эффективность нашего курса.

Не стоит забывать о том что именно дозировка будет решать, какой эффект Вы получите от приема его на курсе, об это ниже.

Дозировки тестостерона пропионат и метана на курсе :

Дозировки метана   на курсе: на протяжении всего курса, рекомендуем принимать по 4 таблетки метана , без горок и прочих излишеств. Как показала практика, которая имеет доказательную базу построенную на анализах, эффективность приема небольшой дозировки в конце курса очень минимальна, исходя из этого не рекомендуем брать во внимание теории разных гуру. Схожая проблема с началом, препарат начнет работать только после накопления определенной дозировки в Вашем организме, не мучайте себя сложными расчетами, которые в результате не дадут эффекта.

Дозировки Тестостерона пропионата на курсе: На протяжении 5 недель, мы рекомендуем воспользоватся схемой приема, где Вам понадобится выполнять иньекции тестостерона по одному кубику через день (100мг)

 

Схема приема курса Метан +Тестостерон Пропионат

Общая схема будет выглядеть следующим образом:

1 — 5 Неделя 

  • Понедельник — 100 мг Тестостерон пропионата  (1 мл) + 40 мг метана  (4 таблетки в сутки)
  • Среда-100 мг Тестостерон пропионата  (1 мл) + 40 мг метана (4 таблетки в сутки)
  • Пятница- 100 мг Тестостерон пропионата  (1 мл) + 40 мг метана  (4 таблетки в сутки)
  • Воскресенье- 100 мг Тестостерон пропионата  (1 мл) + 40 мг метана  (4 таблетки в сутки)

 

Что касается ПКТ, то в комплекте идет 40 таблеток тамоксифена , которые стоит пропить после курса по 2-3 табл в день и желательно затем сдать анализы .

В комплекте возможны изменения в связи с наличием определенных препаратов в данный момент. Мы всегда сможем предложить аналоги или заместители компонентов курса.

Тестостерон пропионат – что это? Курс тестостерона пропионата

В наше время, каждому желающему спортсмену, который хочет ускорить рост мышечной массы, предоставляется огромный выбор стероидных препаратов. Но проблема в том, что не каждый понимает какой препарат лучше, что он собой представляет и как правильно принимать. Сегодня хочу поговорить не обо всех стероидах, а именно об одном – о пропике. Из данной стать вы узнаете подробные ответы на такие вопросы, как: Тестостерон пропионат – что это? Как правильно составить курс тестостерона пропионата? Какая должна быть длительность и дозировки? ПКТ после курса!

Тестостерон пропионат (он же пропик) – является, наверное, одним из самых популярных препаратов в истории бодибилдинга. Обычно, если спросить у человека, какие виды тестостерона он знает, то в большинстве случаев ответ будет – пропик.

 

Данный препарат, предназначенный как для набора мышечной массы и силы, так и для сушки. Хотя, чаще всего его используют именно на сушку, а не

на массу. Пропионат является быстрым эфиром, действия которого уже можно ощутить через небольшой промежуток времени после инъекции. Именно в этом его и преимущество и не достаток.

 

Недостаток, потому, что приходится делать частые инъекции (через день или каждый день), а это как бы, не очень-то удобно. А преимущество – это быстрый эффект и быстрый выход из организма (что очень удобно в конце курса).

 

Данный тестостерон можно комбинировать абсолютно с любым оральным стероидом. Так же, очень часто профессионалы используют его на выходе из курса, что бы организм побыстрее начал восстановление естественного гормонального фона (после пропика естественное восстановление начинается, где то, через 5 – 7 дней, а после других длинных эфиров, через 14 – 18 дней).

 

Стероидный профиль пропика:

  • анаболическая активность: 100% от тестостерона
  • андрогенная активность: 100% от тестостерона (очень большая)
  • ароматизация (конверсия в эстрогены): присутствует (очень большая)
  • подавление оси гипоталамус – гипофиз – яички: умеренно – высокое
  • токсичность для печени: минимальная (если очень большие дозировки) и отсутствует (если мелкие и умеренные дозировки)
  • способ приема: инъекции (как правило, уколы делают: внутримышечно в ягодицы, бедра или дельты)
  • продолжительность жизни в организме: от 48 до 72 часов
  • время обнаружения: от 35 до 45 дней

 

Из-за ярко выраженного андрогенного действия, есть высокая вероятность конверсии в эстрогены (чем выше дозировки, тем больше шансов получить побочку в виде гинекомастии). Поэтому, если вы ставите очень большие дозировки, рекомендую использовать антиэстрогены (тамоксифен, торемифен и прочее).

 

Особенности тестостерона пропионата:

  • ускорение синтеза белка (именно поэтому, во время курса, многие спортсмены подымают белковую пищу в своем рационе на 25 – 50%)
  • слабовыраженная задержка жидкости в организме (именно поэтому, многие атлеты используют его во время сушки)
  • увеличение инсулиноподобного фактора роста в мышцах и печени
  • ускорение восстановления после тяжелых физических нагрузок

 

Положительные эффекты от применения данного препарата:

  • быстрый рост мышечной массы (от 5 до 9кг мышц за 6 недель)
  • незначительное сжигание подкожного жира
  • увеличение наполненности мышц и рельефности
  • быстрый прирост силовых показателей (увеличение рабочего веса на 15 – 30кг за 6 недель)
  • увеличение либидо (отличная эрекция и постоянное сексуальное желание)
  • уменьшает риск ишемии сердца и коронарной болезни

 

Как видите, данный препарат имеет большое количество положительных факторов. Но в этом мире ничего не бывает просто так, и всегда существует вторая сторона медали (побочки).

 

Побочные эффекты пропика:

  • боль, затвердение и покраснение в местах, куда делались инъекции (в большинстве случаев это возникает из-за частых инъекций в одно и тоже место. Что бы избежать данного побочного эффекта, рекомендую чередовать зоны уколов. Например, можно использовать: левую ягодицу, правую ягодицу, левое бедро и правое бедро)
  • повышение агрессии
  • повышенный рост волос на теле
  • подавление выработки собственного тестостерона
  • гинекомастия (из-за высокой ароматизации)
  • прыщи и угри на коже

 

Хочу сказать, что если применять данный препарат без фанатизма, то ярко выраженных побочных эффектов не будет. Побочки начнут проявляться, если вы будете ставить большие дозировки (чем больше дозировки, тем больше шансов поймать побочные эффекты … и наоборот).

 

 

Ну что ж, в общих чертах с данным препаратом ознакомились, теперь давайте поговорим конкретно о курсах. Сейчас я распишу 4 самых ходовых и эффективных курса с пропиком.

 

№1. Курс тестостерона пропионата соло

Данный курс может быть первый и лучше всего подойдет для новичков. Если вы уже провели 2 – 3 курса на оральных препаратах (метан или туринабол) и получили некий эффект, то можете теперь попробовать поставить пропик соло (без комбинирования с другими препаратами). О том, как и на чем лучше всего провести первый курс, читайте в конце статьи, в разделе «другие статьи по теме».

 

Общая информация о курсе:

  • длительность курса соло – 6 недель
  • дозировки курса соло – 100мг в понедельник, среду и пятницу (или вторник, четверг и субботу)
  • пкт после курса тестостерона пропионата соло – присутствует (будем использовать тамоксифен для восстановления естественного гормонального фона)
  • инъекции следует делать утром (лучшие места для уколов, это: ягодичные мышцы и квадрицепсы)
  • отдых после курса пропика соло – 6 недель
  • общее количество препарата на курс – 1800мг (если в одной ампуле 100мг, то на курс нужно – 18 ампул)

 

 

1 неделя: понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг

2 неделя: понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг

3 неделя: понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг

4 неделя: понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг

5 неделя: понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг

6 неделя: понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг

7 неделя: 20мг тамоксифена утром

8 неделя: 20мг тамоксифена утром

9 неделя: 20мг тамоксифена утром

 

Если же вы изначально не курсили оральными препаратами (вообще не хотите принимать их без комбинирования), а сразу решили курсонуть тестостероном, то тогда в этом случаи дозировки урезаются в 2 раза (то есть, теперь вы колите не по 100мг через день, а по 50мг через день).

Теперь, давайте скомбинируем данный стероид с другими оральными препаратами (инъекции + оральные).

 

№2. Курс тестостерона пропионата и туринабола

Отлично подойдет спортсменам, которые уже провели 2 – 3 курса на оральных препаратах и 1 курс на инъекциях. Пропионат и туринабол можно использовать как на массу (такое сочетание стероидов прибавит вам 4 – 7кг сухой и качественной мышечной массы), так и на сушку.

 

Общая информация о курсе:

  • длительность курса – 6 недель
  • дозировки пропика – 100мг в понедельник, среду и пятницу (или вторник, четверг и субботу)
  • дозировки туринабола – 20мг ежедневно
  • 20мг нужно разделить на 2 ровные части и принимать ровным фоном по 10мг в течении дня (утром и ближе к вечеру)
  • принимать таблетки можно двумя способами:
  1. глотать сразу после еды, запивая малым количеством воды (дольше усваивается)
  2. рассасывать под языком перед приемом пищи (быстрее усваивается)
  • пкт после курса тестостерона пропионата и туринабола – присутствует (будем использовать тамоксифен для восстановления естественного гормонального фона)
  • инъекции следует делать утром (лучшие места для уколов, это: ягодичные мышцы и квадрицепсы)
  • отдых после курса – 6 недель
  • общее количество препаратов на курс:
  1. тестостерон пропионат – 1800мг (если в одной ампуле 100мг, то на курс нужно – 18 ампул)
  2. туринабол – 90шт

 

1 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + турик (утром – 10мг / ближе к вечеру – 10г)

2 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + турик (утром – 10мг / ближе к вечеру – 10г)

3 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + турик (утром – 10мг / ближе к вечеру – 10г)

4 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + турик (утром – 10мг / ближе к вечеру – 10г)

5 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + турик (утром – 10мг / ближе к вечеру – 10г)

6 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + турик (утром – 10мг / ближе к вечеру – 10г)

7 неделя: понедельник, вторник, среда – 20мг турика (утром – 10мг и ближе к вечеру – 10мг) / четверг, пятница, суббота, воскресенье – 20мг тамоксифена (утром)

8 неделя: 20мг тамоксифена утром

9 неделя: 20мг тамоксифена утром

 

 

№3. Курс тестостерона пропионата и метана

Отличие данного курса в том, что если скомбинировать пропик с метаном, то вы наберете больше массы, чем в предыдущем случаи. Такое сочетание стероидов способно добавить вам 6.5 – 10кг массы за 6 недель. Но, это не будут чисто сухие и качественные мышцы. Часть массы – это вода, которая уйдет при отмене препаратов (с туриком тоже будет задержка жидкости, но она будет намного меньше).

 

Общая информация о курсе:

  • длительность курса – 6 недель
  • дозировки пропика – 100мг в понедельник, среду и пятницу (или вторник, четверг и субботу)
  • дозировки метана – 30мг ежедневно
  • 30мг нужно разделить на 3 ровные части и принимать ровным фоном по 10мг в течении дня (утром, в обед и вечером)
  • принимать таблетки можно двумя способами:
  1. глотать сразу после еды, запивая малым количеством воды (дольше усваивается)
  2. рассасывать под языком перед приемом пищи (быстрее усваивается)
  • пкт после курса тестостерона пропионата и метана – присутствует (будем использовать тамоксифен для восстановления естественного гормонального фона)
  • инъекции следует делать утром (лучшие места для уколов, это: ягодичные мышцы и квадрицепсы)
  • отдых после курса – 6 недель
  • общее количество препаратов на курс:
  1. тестостерон пропионат – 1800мг (если в одной ампуле 100мг, то на курс нужно – 18 ампул)
  2. метан – 135шт

 

1 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + данабол (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г)

2 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + данабол (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г)

3 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + данабол (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г)

4 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + данабол (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г)

5 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + данабол (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г)

6 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + данабол (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г)

7 неделя: понедельник, вторник, среда – 30мг данабола (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г) / четверг, пятница, суббота, воскресенье – 20мг тамоксифена (утром)

8 неделя: 20мг тамоксифена утром

9 неделя: 20мг тамоксифена утром

 

 

№4. Курс тестостерона пропионата и винстрола (станозолола)

Данное комбинирование препаратов можно использовать как на массу, так и на сушку. Но чаще всего его используют именно во время сушки (так как винстрол не задерживает жидкость в организме и делает ваши мышцы жестче).

 

Общая информация о курсе:

  • длительность курса – 6 недель
  • дозировки пропика – 100мг в понедельник, среду и пятницу (или вторник, четверг и субботу)
  • дозировки винстрола – 40мг ежедневно
  • 40мг нужно разделить на 4 ровные части и принимать ровным фоном по 10мг в течении дня (через каждые 4 – 5 часа)
  • принимать таблетки можно двумя способами:
  1. глотать сразу после еды, запивая малым количеством воды (дольше усваивается)
  2. рассасывать под языком перед приемом пищи (быстрее усваивается)
  • пкт после курса тестостерона пропионата и винстрола – присутствует (будем использовать тамоксифен для восстановления естественного гормонального фона)
  • инъекции следует делать утром (лучшие места для уколов, это: ягодичные мышцы и квадрицепсы)
  • отдых после курса – 6 недель
  • общее количество препаратов на курс:
  1. тестостерон пропионат – 1800мг (если в одной ампуле 100мг, то на курс нужно – 18 ампул)
  2. винстрол – 177шт

 

1 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + станозолол (08:00 – 10мг / 13:00 – 10мг / 18:00 – 10мг / 23:00 – 10мг)

2 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + станозолол (08:00 – 10мг / 13:00 – 10мг / 18:00 – 10мг / 23:00 – 10мг)

3 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + станозолол (08:00 – 10мг / 13:00 – 10мг / 18:00 – 10мг / 23:00 – 10мг)

4 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + станозолол (08:00 – 10мг / 13:00 – 10мг / 18:00 – 10мг / 23:00 – 10мг)

5 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + станозолол (08:00 – 10мг / 13:00 – 10мг / 18:00 – 10мг / 23:00 – 10мг)

6 неделя: тест (понедельник – 100мг / среда – 100мг / пятница – 100мг) + станозолол (08:00 – 10мг / 13:00 – 10мг / 18:00 – 10мг / 23:00 – 10мг)

7 неделя: понедельник, вторник, среда – 30мг станозолола (утром – 10мг / в обед – 10мг / вечером – 10г) / четверг, пятница, суббота, воскресенье – 20мг тамоксифена (утром)

8 неделя: 20мг тамоксифена утром

9 неделя: 20мг тамоксифена утром

 

Как вы видите, я использовал такие дозировки оральных препаратов:

  • турик – 20мг
  • метан – 30мг
  • винстрол – 40мг

 

Это условные дозировки. Вы же можете использовать 40мг как на турике и метане, так и на винстроле. Подбирать дозировку нужно под себя, учитывая стаж (юный «химик» или продвинутый). Рекомендуемая суточная доза оральных препаратов: 20 – 40мг. Чем выше доза, тем сильнее нагрузка на печень. Если хотите увеличить дозировку, то лучше увеличьте за счет инъекций, а не за счет таблеток.

 

Основную информацию вы получили. Теперь у вас не буде возникать вопрос: «Тестостерон пропионат – что это такое?». В статье все подробно и ясно расписано. Вам же остается выбрать: курсить или не курсить.

 

В данной статье не ведется пропаганда употребления стероидов, а так же их реклама. Все написано в ознакомительных целях!

 

С уважением, Сергей Гарбарь

 

 

Другие статьи по теме:

 

нандролон фенилпропионат + тестостерон пропионат на массу и сушку!

Не важно, какую цель преследует человек – он всегда хочет достичь ее максимально быстро. Именно поэтому, при работе на массу и сушку, много мужчин начинают использовать стероиды. Но, данные препараты не очень хорошо влияют на ваше здоровье, поэтому, нужно осторожно подходить к выбору и дозировкам. Если вы не знаете с чего начать, то предлагаю вам короткий курс стероидов: нандролон фенилпропионат + тестостерон пропионат, который можно использовать на массу и сушку (рельеф). Так же, вы узнаете, какая должна быть длительность, дозировки и ПКТ после курса.

Его можно использовать, как первый курс стероидов для новичков. Данные эфиры являются короткими, поэтому в случае повышенных побочных эффектов можно быстро спрыгнуть с курса (это крутой плюс). Но, так как здесь связка из 2х препаратов, то я все же рекомендую использовать его примерно на 3й курс. Если вы новичок, то первый курс может быть соло на метане или туринаболе. Второй курс на метане + тестостероне пропионате. Ну а в качестве третьего курса, можно использовать этот.

 

Нандролон фенилпропионат (Nandrolona F) – является таким же мощным препаратом, как дека. Но, так как это эфир краткого действия и в меньшей степени задерживает жидкость в организме, то его можно использовать как на массу, так и на сушку. Эфирная цепочка фенилпропионата короче, чем у деки, поэтому действующее вещество быстрее всасывается в кровоток, что позволяет быстрее запустить активную фазу (первый эффект уже сможете почувствовать через несколько дней, чего не скажешь про деку). И по этой же причине, активная фаза быстрее заканчивается.

 

Так как данный препарат является эфиром, который кратковременно воздействует на организм, то вам придется делать частые инъекции (это можно списать на его недостаток). Но, если посмотреть с другой стороны, то в случае сильных побочных эффектов или индивидуальной непереносимости, можно быстро спрыгнуть с курса и его активное действие прекратиться через несколько дней (это отличное преимущество, особенно если вы используете нандролон первый раз).

 

Нандролон фенилпропионат можно комбинировать с оральными препаратами и эфирами тестостерона. Кроме этого, если оральными препаратами можно пренебречь, то тестостерон обязательно должен присутствовать на курсе, причем дозировки тестостерона должны быть в 1.5 – 2 раза выше, чем фенилпропионата. Так же, очень часто опытные атлеты используют данный препарат на выходе из курса (начинают колоть деку, а заканчивают nandrolona F). Такой ход очень логичный, потому что позволяет практически сразу после отмены всех препаратов начать восстановление собственного гормонального фона.

 

Стероидный профиль Nandrolona F:

  • анаболическая активность: 150% от тестостерона
  • андрогенная активность: 30% от тестостерона (низкая)
  • ароматизация (конверсия в эстрогены): присутствует (низкая)
  • подавление оси гипоталамус – гипофиз – яички: умеренно – высокое
  • токсичность для печени: минимальная (если очень большие дозировки) и отсутствует (если минимальные)
  • способ приема: инъекции (лучшие места для инъекций, это ягодицы и квадрицепсы)
  • продолжительность жизни в организме (активная фаза): от 48 до 96 дней
  • общее время обнаружения: от 15 до 18 месяцев

 

Положительные эффекты:

  • ускоренный синтез белка
  • снижение потерь белка клетками
  • стимулирует процесс регенерации связок и суставов
  • ускоренное восстановление организма после физических нагрузок
  • укрепляет иммунитет
  • ускоренный рост силы и массы
  • в меньшей степени задерживает жидкость в организме, чем дека
  • повышается антикатаболическое воздействие на организм

 

Побочные эффекты нандролона фенилпропионата:

  • возможное проявление гинекомастии
  • подавление производства собственного тестостерона
  • возможное проявление прыщей на теле
  • возможное проявление повышенного артериального давления

 

Сам по себе нандролон в любой его форме – очень мощный препарат. Он дает вам мощные положительные эффекты, и такие же мощные побочные эффекты (чем сильнее препарат, тем выше его эффективность и параллельно этому – побочные эффекты). Чтобы минимизировать вред здоровью и появление побочек, не рекомендую ставить сверх дозы. Если будете делать все с умом, то не нанесете вреда своему организму.

 

 

Короткий курс стероидов №1 – нандролон фенилпропионат + тестостерон пропионат:

Данный курс можно использовать как на массу, так и на сушку. Все равно, основной ключ к успеху – это питание. Стероиды же вас просто укоряют в достижении определенной цели. Этот курс будет использоваться по принципу 4 + 4 (4 недели курс + 4 недели отдых). Можно делать 5 + 5 / 6 + 6 и выше. Это уже смотрите по собственному опыту. Не рекомендую делать курсы 3 + 3 и меньше, так как эффект будет крайне слабым (минимальная эффективная длительность – это 4 + 4).

 

Краткая информация о данном курсе:

  • длительность курса – 4 недели
  • дозировки фенилпропионата – 200мг в неделю
  • дозировки пропика – 400мг в неделю
  • пкт после курса фенилпропионат + тестостерон пропионат – присутствует (будем принимать кломид, чтобы быстрее восстановить свой естественный гормональный фон)
  • инъекции нужно делать в утреннее время суток (лучше всего делать в ягодицы или квадрицепсы)
  • отдых после курса – 4 недели
  • общее количество препаратов на курс:
  1. фенилпропионат – 800мг
  2. пропионат – 1600мг
  3. кломид – 650мг

 

Неделя №1:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота)

Неделя №2:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота)

Неделя №3:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота)

Неделя №4:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота)

Неделя №5: кломид – 50мг каждое утро (ежедневно)

Неделя №6: кломид – 50мг утром (через день)

 

Так как данный курс рассчитан на человека, который является новичком (хотя ранее он уже и провел 1 – 2 курса), то дозировки не такие уж и большие. Если вы опытный бодибилдер, то можете поднять дозировки. Главное помните, что тестостерона должно быть в 1.5 – 2 раза больше (не рекомендую превышать дозировку нандролона выше, чем 600мг в неделю). Так же, можно не повышать дозировки инъекционных препаратов, а просто добавить какой-то оральный препарат (метан, туринабол, станозолол). Пример, смотрите ниже.  

 

Короткий курс стероидов №2 – нандролон фенилпропионат + тестостерон пропионат + метан (туринабол / станозолол)

 

Краткая информация о данном курсе:

  • длительность курса – 4 недели
  • дозировки фенилпропионата – 200мг в неделю
  • дозировки пропика – 400мг в неделю
  • дозировки оральных препаратов (метан / туринабол / станозолол) – 20мг в день
  • пкт после курса – присутствует (будем принимать кломид, чтобы быстрее восстановить свой естественный гормональный фон)
  • инъекции нужно делать в утреннее время суток (лучше всего делать в ягодицы или квадрицепсы)
  • таблетки нужно разделить на 2 приема (10мг утром + 10мг вечером)
  • таблетки можно принимать 2 способами (глотать, запивая водой после еды или рассасывать под языком перед едой)
  • отдых после курса – 4 недели
  • общее количество препаратов на курс:
  1. фенилпропионат – 800мг
  2. пропионат – 1600мг
  3. оральный стероид (метан / туринабол / станозолол) – 560мг
  4. кломид – 650мг

 

Неделя №1:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота) / оральный стероид «метан / туринабол / станозолол» – 20мг каждый день (10мг утром + 10мг вечером)

Неделя №2:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота) / оральный стероид «метан / туринабол / станозолол» – 20мг каждый день (10мг утром + 10мг вечером)

Неделя №3:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота) / оральный стероид «метан / туринабол / станозолол» – 20мг каждый день (10мг утром + 10мг вечером)

Неделя №4:  фенилпропионат – 100мг (вторник + пятница) / пропик – 100мг (понедельник + среда + четверг + суббота) / оральный стероид «метан / туринабол / станозолол» – 20мг каждый день (10мг утром + 10мг вечером)

Неделя №5: кломид – 50мг каждое утро (ежедневно)

Неделя №6: кломид – 50мг утром (через день)

 

Не советую сильно увлекаться оральными препаратами, так как они очень негативно влияют на печень. Если есть необходимость в повышении дозировок, то делайте это за счет инъекционных препаратов, а применение оральных – сведите к минимуму. Короткий курс стероидов: нандролон фенилпропионат + тестостерон пропионат является универсальным курсом, так как он отлично подходит, как при работе на массу, так и на сушку (рельеф).

 

В данной статье не ведется пропаганда употребления стероидов, а так же их реклама. Все написано в ознакомительных целях!

 

С уважением, Сергей Гарбарь

 

 
Другие статьи по теме:

 

Метан (метандиенон) таблетки для мышц. Инструкция по применению, цена

Темой нашей статьи станет препарат «Метандростенолон». Он более известен под сокращенным названием «метан». Это анаболический стероид, представляющий собой таблетки белого цвета по 5 мг. Выпускается препарат в упаковках по 100 и 300 единиц. Таблетки «метан» в бодибилдинге применяются для наращивания мышечной массы. Они задерживают в организме жидкость, и в связи с этим происходит стремительный рост мышечной массы. После прекращения употребления препарата вес так же стремительно снижается.

Показания к применению

Препарат «метан» характеризуется очень быстрой усвояемостью в ЖКТ и низкой биодоступностью. После всасывания в кровь он подвергается биопревращению в печени. Выводится из организма почками. Показания к его применению – нарушения белкового обмена, астения, инфекционные заболевания. Кроме того, его нередко назначают больным после серьезных операций, обширных ожогов и травм.

Препарат используют в разных отраслях медицины. Он успешно применяется в эндокринологии, травматологии, терапии.

Как принимать «Метан»?

Оптимальная дозировка – 30 мг в день в течение 6 недель. Совмещая эту дозу с корректорами («Холосасом», «Тамоксифеном» и другими), а также правильно питаясь, можно существенно улучшить спортивную форму. Удобно принимать «Метан» (таблетки), отзывы всегда положительные.

«Метан» пользуется большой популярностью еще и потому, что он доступен по цене и распространенности, его легко приобрести в аптеках и специализированных магазинах. Нужно понимать, что без физической нагрузки прием «Метана» бесполезен. Можно сравнить эффект препарата «Метан» (отзывы), фото до и после приема. Простое сравнение показывает приличную разницу в результатах.

Побочные эффекты

Надо признать, что стероид «метан» — не очень полезный препарат. Причина этого — наличие серьезных противопоказаний и побочных эффектов. Среди них – задержка выработки мужского гормона, негативное влияние на печень.

Какие еще последствия может иметь прием препарата под сокращенным названием «метан»? В бодибилдинге не приветствуют его применение, так как в его состав входит свободный радикал 17-альфа, отравляющий печень. Он вызывает застой желчи, поэтому нередко спортсмены испытывают боли или тяжесть в правом боку. Кроме того, велика вероятность нарушения репродуктивной функции.

Среди самых серьезных побочных эффектов препарата – рак предстательной железы, тяжелые формы простатитов, рак молочной железы, инфаркт миокарда, гиперкальциемия.

Прародитель «Метана»

Химики синтезировали препарат «Метандростенолон» на основе формулы главного мужского гормона тестостерона. Именно благодаря тестостерону и препаратам, повторяющим его действие, наращивается мышечная масса и максимально быстро усваивается животный белок из пищи. Кости и мышцы не только быстро растут, но и практически мгновенно восстанавливаются после травм и ушибов. Под действием «Метана» и его аналогов из пищи в тонком кишечнике быстро всасываются аминокислоты или строительный материал белка. «Метан» также задерживает в организме азот, мочевина меньше выделяется почками. Организм аккумулирует не только чистый белок, но и все, что необходимо для его синтеза: фосфор, калий и серу. Кальций также остается в организме, причем сразу устремляется в кости. Благодаря этим свойствам и стал так популярен «Метан». Отзывы о нем иногда скрывают обратную сторону медали.

«Метан» в бодибилдинге: отзывы спортсменов

Среди бодибилдеров мнения о препарате разнятся. Одни считают его чудодейственным средством, другие – «белым убийцей». Так что это такое — «метан» — и где истина? По мнению большинства спортсменов, это препарат, который действительно работает. Однако применение одного этого средства не приведет ни к чему хорошему. Его нужно сочетать с другими препаратами аналогичного действия, чтобы эффект был сильнее при уменьшении дозы.

Чтобы избежать проблем с печенью, следует принимать желчегонные препараты.

Зачем нужен «Метан» спортсмену?

В качестве допинга «Метандростенолон» стал использоваться во второй половине прошлого века. Произошло это исключительно благодаря таким его свойствам: под действием «Метана» у спортсменов увеличивалась мышечная масса, а жир просто таял. В то время допингом считался разве что кокаин. Препарат «Метан», отзывы о котором взорвали тогдашнюю спортивную общественность, был отнесен к допингам только в 1993 году. Причиной этого явилось множество смертей тех спортсменов, которые принимали препарат бесконтрольно.

В самом начале никто не знал о том, что причиной смерти может быть «Метан». Отзывы, выражающие восторг, сменяли друг друга. Препарат способен подстегивать нервную и эндокринную системы, а обвальные сведения о побочных действиях появились позже.

Курс «метана»

Чтобы терапия анаболиками прошла по возможности более мягко для спортсмена, важно, чтобы их применение совпадало с биоритмами человека. При приеме препарата «метан» два раза в день результаты могут быть несколько ниже ожидаемых, но такая схема нанесет меньше вреда, чем в случае его применения через четыре часа, как делают многие бодибилдеры. Такой прием вызывает быстрое привыкание, поэтому не стоит использовать средство более недели. Оптимальной дозой считаются четыре-пять таблеток в день (20-25 мг). Продолжительность курса ни в коем случае не должна превышать двадцати восьми дней – за такой срок организм не успеет слишком привыкнуть к препарату. После окончания курса отдыхайте от стероидов и восстанавливайте печень или же начинайте принимать другой препарат.

Что такое «Метан»?

Этот препарат давно известен как анаболический стероид, способствующий быстрому росту мышечной массы. Анаболический – значит ускоряющий обновление клеток и состоящих их них тканей. Под воздействием анаболиков из простых веществ образуются сложные молекулы, процесс сопровождается накоплением энергии. В медицине анаболики используются для ускорения выздоровления после истощающих заболеваний, для усиления аппетита, увеличения накопления кальция в костях и фосфора в зубах.

Под воздействием стероидов улучшается деятельность мозга, выносливость, повышается содержание кислорода в тканях. Множество больных людей по всему миру обязаны своим выздоровлением именно анаболическим стероидам.

Известные заблуждения

Многие считают, что таблетки «метан» (в бодибилдинге его прием не приветствуется) следует не пить, а рассасывать. Объясняют это тем, что таким образом он меньше травмирует печень, так как через сосуды, расположенные в ротовой полости, он сразу же всасывается в кровь. Не верьте тем, кто посоветует вам такую форму приема – все, что попадает в кровь, в любом случае попадает в печень. Более того, рассасывание препарата нанесет вашей печени гораздо больший вред.

Существует еще одно весьма распространенное заблуждение: анаболик «метан» (в бодибилдинге его применение — не редкость) будет менее опасен, если его растворить в растительном масле и выпить. Это объясняют тем, что якобы в таком случае препарат поступает в организм не из желудка, а из кишечника, минуя при этом портальную вену и не травмируя печень. Естественно, такое утверждение — это всего лишь миф. И при такой форме приема печень травмируется ничуть не меньше.

И в заключение заблуждение № 3. Есть мнение, что если от приема таблеток «метана» у вас появляются боли в области желудка, то принимать его следует во время еды. Всем, кто сталкивался с такой проблемой, необходимо знать, что это — полная ерунда. Если появились боли, то прием препарата следует прекратить. Он принесет вам больше вреда, чем пользы!

Противопоказания к применению:

— артериальная гипертензия;

— заболевания печени;

— гипертрофия предстательной железы;

— изменения состава крови;

— возраст до 21 года.

Когда принимать «Метан»?

«Метан» могут принимать мужчины в возрасте от 21 до 40 лет, т.е. в том возрасте, когда синтез собственного тестостерона находится на пике. В этом периоде вред для организма минимальный. Соответственно, побочные и вредные воздействия тоже сведены к минимуму. В возрасте до и после указанного промежутка побочных действий не избежать. Лучше всего посоветоваться с тренером о том, как использовать «Метан». Как принимать новичку, со знанием дела подскажут опытные силовики.

Всегда нужно помнить о том, что расщепление «Метана» происходит в печени. Поэтому токсическое действие на печень встречается очень часто. Если какие-то болезни печени уже есть, то прием Метана» однозначно противопоказан. Дело в том, что производные «Метана» затрудняют отток желчи, а также непосредственно повреждают гепатоциты. Очень полезно одновременно с «Метаном» принимать «Холосас» или экстракт плодов шиповника. Это отличное желчегонное средство, лучшая профилактика застойных явлений.

Иногда на фоне приема «Метана» повышается артериальное давление, это следствие расщепления препарата до эстрогенов. Нивелировать это, если нет болезней, можно препаратами типа «Тамоксифена», противодействующего эстрогенам.

У женщин может появиться маскулинизация или развитие вторичных мужских половых признаков.

Главное правило при приеме анаболиков – полное исходное здоровье. Наличие каких-либо болезней исключает использование «Метана» и подобных препаратов. У здоровых, полностью сформированных мужчин благоприятно проходит первый курс «Метана». Отзывы новичков и профессионалов одинаково положительные.

Как правильно использовать провирон?


Без вспомогательных препаратов вам не удастся провести безопасный анаболический курс. Если атлет имеет генетическую предрасположенность к ароматизации, то на первом курсе метана соло для новичка используйте ежедневно по 50 миллиграмм местеролона за два приема. В будущем, если вы будете проводить тяжелые циклы, то дозировку провирона придется увеличить до 0.1 грамма.
Когда в состав цикла входят ароматизирующиеся ААС, в первую очередь речь идет о тесто, то начиная с восьмого дня курса, принимайте по 50 миллиграмм местеролона каждый день. Если у вас с генетикой все хорошо, то рекомендуем перестраховаться и использовать провирон в количестве 25 миллиграмм. Иногда из-за работы глобулина примерно на пятой неделе курса эффективность ААС может снизиться. В такой ситуации вам снова стоит использовать провирон, ведь он отлично ингибирует глобулин.

Если вы решили просушиться, то благодаря местеролону можно значительно увеличить твердость мускулов. Для решения этой задачи принимайте его каждый день по 50 миллиграмм. Следует заметить, что этот препарат активно используется не только атлетами, но и актерами или фотомоделями перед съемками. Также запомните — чем ниже в организме концентрация эстрогенов перед стартом ПКТ, тем быстрее вы восстановитесь.

В заключение несколько слов о тамоксе. Этот препарат вызывает много спором на тему целесообразности его использования на анаболическом курсе. Исходя из собственного практического опыта, тамоксифен является отличным средством для проведения ПКТ. В ходе нескольких исследований было доказано, что суточная доза в 20 миллиграмм позволяет на протяжении 14 суток восстановить концентрацию тесто на 50 процентов от начального уровня. После анаболического цикла это для вас задача номер один.

Смотрите видео про Метандиенон:

Особенности приема «Метана»

Суточную дозу нужно разделить на 2 или 3 приема. Большую часть дозы – 20 мг – лучше всего принимать утром натощак. Так быстро запускается метаболизм и эффект будет наибольшим. Можно посоветоваться с провизором или тренером о том, как принимать «Метан» в таблетках. Оставшуюся часть или 10 мг можно принять в обед, но уже после еды. Так удастся избежать застоя желчи. Нужно стараться всю дозу принять в первой половине дня. Также желательно прислушиваться к реакции своего организма и помогать ему при любом сбое.

Режим тренировок и питание во время приема Метандростенолона

Препарат, согласно рекомендациям специалистов не стоит употреблять дольше четырех недель, после которых обязательно должен следовать месячный восстановительный период.

  1. Во время приема нужно следить за питанием — без него невозможно достичь нужного эффекта. Стероид оказывает сильное воздействие на белковый обмен. Поэтому в меню должно входить достаточное количество белков.
  2. Период полураспада вещества занимает около 2 часов. Для достижения оптимальной концентрации и максимального его воздействия на организм лучше выполнять прием с 12-часовым перерывом в промежуток с 6 до 8 утра и вечера.
  3. Атлетам со стажем, много времени уделяющим тренировкам, средство можно использовать до 1,5 месяцев 4 раза в день со стандартными четырехчасовыми перерывами.

Режим тренировок при приеме стабильно через день по 45 мин. Если суточного промежутка между занятиями для восстановления недостаточно, то время отдыха должно быть увеличено.

Комбинированные курсы «Данабола»

Ввиду довольно частого проявления побочных эффектов от применения средства «Метандростенолон» и узкой широты положительных результатов, знающие люди рекомендуют совмещать этот препарат вместе с приемом других анаболических стероидов. Сама доза «Данабола» в этом случае колеблется в промежутке от 10 до 30 мг. Такое комбинирование дает возможность увеличивать эффективность курса, снижая при этом частоту возникновения побочных эффектов, по причине различной фармакодинамики препаратов. Необходимо помнить, что любое сочетание предполагает строго определенную дозу для каждого средства и специфический режим приема. Примером комбинации может быть «Метан» для роста мышц и «Винстрол» для рельефа. Но по поводу этих стероидов лучше проконсультироваться с профессиональным тренером.

Почему на первом курсе стоит использовать метан?


Начнем разговор с описания этого популярнейшего стероида. Он является сильным анаболиком, обладая при этом умеренной андрогенной активностью. Именно метандиенон стал первым ААС, который стал активно использоваться спортсменами. Это классический массонаборный препарат, позволяющий одновременно увеличить силовые параметры. Если вы достигли своего генетического предела или вплотную к нему приблизились, то с помощью метандиенона сможете шагнуть дальше.
В целом препарат является достаточно безопасным, и наибольшие проблемы могут доставить только эстрогенные побочки. Для их устранения вполне подойдет провирон. Проводя первый курс метана соло для новичка, следует помнить о некоторых рисках появления и андрогенных негативных эффектов. Однако они во многом связны с генетикой и проявляются сравнительно редко. Чтобы получить максимальный эффект от курса, вам необходимо хорошо питаться, тяжело тренироваться и обязательно высыпаться.

Начинающим спортсменам нет необходимости в проведении комбинированных циклов или применении сильных ААС. Подобный подход к составлению курса может лишь принести вред организму. Рассмотренный нами сегодня первый курс метана соло для новичка поможет вам избежать этого и при этом сделать широкий шаг вперед.

Ингибирование ферментации пропионата до метана водородом, ацетатом и пропионатом

Abstract

Ингибирование ферментации пропионата до метана и диоксида углерода водородом, ацетатом и пропионатом было проанализировано с помощью акклиматизированного мезофильного пропионата ила, который состоял из многочисленных хлопьев (размером от 150 до 300 мкм). Акклиматизированный ил может превращать пропионат в метан и диоксид углерода стехиометрически без накопления водорода и ацетата в среде с минимальным содержанием пропионата.Ингибирование использования пропионата пропионатом может быть проанализировано с помощью модели ингибирования субстрата второго порядка (показанной ниже), учитывая, что константа насыщения субстрата, K с , составляла 15,9 мкМ; константа ингибирования субстратом, K i , составляла 0,79 мМ; а максимальная удельная скорость использования пропионата, q m , составляла 2,15 ммоль / г смешанных летучих взвешенных твердых веществ (MLVSS) в день: q с = q m S / [ K s + S + ( S 2 / K i )], где q 5 s — 5 s удельная скорость использования пропионата, а S — начальная концентрация недиссоциированной пропионовой кислоты.Для ингибирования утилизации пропионата водородом и ацетатом использовалась модель ингибирования неконкурентоспособного продукта: q s = q m / [1 + ( P / K p ) n ], где P — начальная концентрация водорода или недиссоциированной уксусной кислоты, а K p — константа ингибирования. Кинетический анализ показал для ингибирования водородом K p (H 2 ) = 0.11 атм (= 11,1 кПа, 71,5 мкМ), q m = 2,40 ммоль / г MLVSS в день и n = 1,51, а для ингибирования ацетата K p (HAc ) = 48,6 мкМ, q м = 1,85 ммоль / г MLVSS в день, а n = 0,96. Можно сделать вывод, что увеличение концентрации недиссоциированной пропионовой кислоты было ключевым фактором в ингибировании утилизации пропионата, и что водород и ацетат совместно ингибировали разложение пропионата, предполагая, что гидрогенотрофные и ацетокластические метаногены могут играть важную роль в усилении разложения пропионата до метана и углерода. диоксид.

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (873K) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Эти ссылки есть в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

Влияние метаногенных прекурсоров (ацетата, водорода, пропионата) на подавление образования метана нитратами в бескислородной почве рисовых полей | FEMS Microbiology Ecology

555″ data-legacy-id=»ss1″> 1 Введение

Неуклонное увеличение концентрации CH в атмосфере 4 может иметь важные последствия для глобального климата [1].Аноксические почвы, такие как рисовые поля, являются основным источником атмосферного CH 4 . На них может приходиться до 20% глобального атмосферного бюджета CH 4 [2–4]. В условиях роста мирового населения и спроса на рис в будущем необходимы стратегии по смягчению последствий увеличения выбросов CH 4 после расширения выращивания риса. С этой точки зрения, поскольку метаногенные археи ответственны за производство CH 4 на рисовых полях, важно лучше понять экологию этих микроорганизмов в их среде обитания.В анаэробных и восстановленных условиях метаногены производят CH 4 либо в результате восстановления CO 2 с помощью H 2 (гидрогенотрофный), либо в результате ферментации ацетата до CH 4 и CO 2 (уксусно-пластический) [5 ]. В природе на последний механизм приходится около двух третей выбрасываемых CH 4 [6]. В стационарных условиях на бескислородных рисовых полях уксусно-пластический путь является доминирующим и составляет около 75–80% от общего количества выбрасываемых CH 4 [7,8].

В бескислородной почве рисового поля добавление NO 3 , Fe 3+ и SO 2– 4 приводит к подавлению образования CH 4 [9]. Было обнаружено, что анаэробные бактерии вытесняют метаногены, используя либо SO 2- 4 , либо Fe 3+ в качестве концевого акцептора электронов для H 2 , обычного метаногенного субстрата [9,10]. Было обнаружено, что сульфатредуцирующие бактерии в пресноводных отложениях имеют более низкую константу полунасыщения и порог поглощения H 2 , чем метаногены, что приводит к более низкому парциальному давлению H 2 , когда сульфат доступен, что предотвращает активность метаногенов [11, 12].Сообщалось также о подобном конкурентном механизме ацетата между сульфатредуцирующими бактериями и метаногенами [13,14]. Другие исследования пресноводных отложений показали, что бактерии, восстанавливающие трехвалентное железо, также превосходят сульфатредуцирующие бактерии и метаногены по H 2 и ацетату [15].

Случай подавления образования CH 4 нитратом изучен не так тщательно, как сульфат. Тем не менее, были постулированы три механизма подавления нитратами.Первая гипотеза состоит в том, что нитрат увеличивает окислительно-восстановительный потенциал, что препятствует активности метаногенов [16]. Однако недавно было показано, что высокие положительные окислительно-восстановительные потенциалы (+420 мВ) не предотвращают ни инициацию метаногенеза в бескислородной рисовой почве [8], ни продукцию CH 4 в аксенических культурах Methanosarcina barkeri [17] и что CH 4 Производство в анаэробном иловом реакторе было подавлено после добавления нитрата, несмотря на поддержание окислительно-восстановительного потенциала на уровне -290 мВ [18].Точно так же эксперименты на отложениях солончаков с растворами нитратов и резазурином в качестве индикатора окислительно-восстановительного потенциала не обнаружили никакой разницы, когда окислительно-восстановительный потенциал поддерживался на отрицательных значениях с помощью цистеина [19]. Недавно в бескислородной рисовой почве или на аксенических культурах Methanosarcina barkeri и Methanobacterium bryantii не наблюдалось увеличения окислительно-восстановительного потенциала после добавления нитрата, нитрита, NO или N 2 O во время подавления CH. 4 производство [7,20].Таким образом, мы считаем, что эта гипотеза больше не действительна, и не рассматриваем ее специально в данной статье.

Вторая гипотеза — это механизм конкуренции между денитрифицирующими бактериями и метаногенами для обычных субстратов (ацетат, H 2 ), аналогичный механизму, обнаруженному для подавления продукции CH 4 сульфатом или трехвалентным железом [16,21]. Было обнаружено, что добавление нитрата или промежуточных продуктов денитрификации к метаногенным растворам почвы приводит к снижению парциального давления H 2 , что можно интерпретировать как результат конкуренции за H 2 между денитрификаторами и метаногенами [7].Однако концентрация ацетата в почвенных суспензиях не снижалась после добавления нитрата, что указывает на то, что конкуренция не может быть механизмом, ответственным за ингибирование уксусно-пластического метаногенеза [20]. Более того, в солончаке выработка CH 4 подавлялась нитратами, даже если во время экспериментов присутствовали избыток H 2 и CO 2 [19].

Третья гипотеза заключается в том, что денитрификация приводит к накоплению промежуточных продуктов (нитрит, NO, N 2 O), токсичных для метаногенных архей.Эта гипотеза была сформулирована Бальдерстоном и Пейном [19] после изучения отложений солончака. Действительно, промежуточные продукты денитрификации оказались токсичными для аксенических культур Methanobacterium thermoautotrophicum , Methanobacterium formicicum , Methanosarcina barkeri и Methanobacterium bryantii [19,20]. Поэтому было высказано предположение, что токсичные интермедиаты денитрификации ответственны за ингибирование метаногенеза в бескислородных рисовых почвах [7].

Мы проанализировали влияние добавления доноров электронов (ацетат, H 2 , пропионат) на подавление продукции CH 4 нитратами в почве рисовых полей. Если конкурентная модель является основным механизмом подавления метаногенеза, добавление ацетата или H 2 должно ослабить, по крайней мере частично, подавление продукции CH 4 . Однако в противном случае, если не наблюдается ослабления подавления, можно было бы сделать вывод, что основным механизмом является токсичность, а не конкуренция.Мы использовали концентрации нитратов (<10 мМ), которые реалистичны для почвы рисовых полей, особенно с учетом обычно высоких норм внесения удобрений (200 кг N га -1 , что эквивалентно 143 мкмоль см -2 ).

563″ data-legacy-id=»ss2-1″> 2.1 Образцы почвы

Образец почвы, использованной в этой работе, был взят в 1995 году с рисовых полей Научно-исследовательского института риса недалеко от Арборио, в долине реки По, Италия. Текстура почвы была подобна почве из Верчелли, описанной в другом месте [9,22].Как сообщалось ранее [8], содержание органического углерода составляло 1,9% (мас. / Мас.). Почву сушили на воздухе и хранили при комнатной температуре. Комки сухой почвы измельчали ​​с помощью механического измельчителя и просеивали через сито 0,5 мм. Суспензии почвы готовили в 1-литровых колбах Эрленмейера с завинчивающейся крышкой (Ochs, Göttingen-Bovenden, Германия) с соотношением почва: вода 1 г сухой массы (сухой массы) почвы на 1 мл воды. Всего в каждую колбу добавляли 250 или 500 г почвы (сухой вес) плюс 250 или 500 мл стерильной бидистиллированной воды.Каждую колбу закрывали латексной пробкой и навинчивались на нее сверху. Затем почвенную суспензию барботировали газом N 2 (15 мин) с использованием метода иглы Хангейта и статически инкубировали при 25 ° C. Для каждого эксперимента были подготовлены три колбы для определения газа (CH 4 , N 2 O, NO) с помощью газовой хроматографии (ГХ) и две колбы для отбора проб жидкости (подробнее см. [8]). Образцы суспензии (приблизительно 10 мл) отбирались под действием силы тяжести через боковой порт, расположенный на дне колб, в пластиковую пробирку для определения pH и окислительно-восстановительного потенциала, как описано в другом месте [8].Поровую воду также экстрагировали из суспензии почвы в микроцентрифужных пробирках (1,5 мл) с помощью микроцентрифугирования (14 000 об / мин, 10 мин). Супернатант замораживали до химического анализа анионов (NO 2 , NO 3 , SO 2 — 4 ) с помощью ионной хроматографии и органических кислот с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. (ВЭЖХ). Суспензии почвы инкубировали 20 или 37 дней, чтобы обеспечить полное восстановление нитрата, трехвалентного железа и сульфата и обеспечить линейную скорость производства CH 4 .

2.3 Аналитические методы

Концентрации газа определяли методом газовой хроматографии [24]. Метан измеряли на приборе Carlo Erba Instrument с колонкой Porapak Q, N 2 в качестве газа-носителя и пламенно-ионизационным детектором (FID) [8].Концентрацию водорода (<10 Па) измеряли на восстановительном газоанализаторе (RGD2) с колонкой молекулярного сита и синтетическим воздухом в качестве газа-носителя [8]. Закись азота измеряли на приборе Carlo Erba с колонкой Porapak Q, He в качестве газа-носителя и детектором захвата электронов (ECD) [25]. Оксид азота измеряли на термоэлектронном хемилюминесцентном анализаторе NO x [26]. В экспериментальных условиях, используемых для этих экспериментов, парциальное давление газообразного соединения 1 кПа было эквивалентно в целом 25 мкмоль этого соединения в свободном пространстве колбы.

Концентрации органических кислот (ацетата и пропионата) в поровой воде измеряли с помощью ВЭЖХ с детектором индекса тугоплавкости (Sykam, Gauting, Германия) [8]. Концентрации нитратов и нитритов в поровой воде измеряли с помощью ВЭЖХ с использованием УФ-детектора, установленного на 218 нм.

2.4 Статистический анализ

Каждый эксперимент проводили в дублирующих колбах. Чтобы обеспечить возможность стехиометрического сравнения между различными реагентами и продуктами, измеренными в ходе этих экспериментов, мы рассчитали все скорости как мкмоль на колбу в день.В наших экспериментальных почвенных микрокосмах 1 мкмоль на колбу в день был эквивалентен 33 нмоль на грамм сухого веса. в день. Скорость производства газов или потребления нитратов или доноров электронов рассчитывалась с помощью линейной регрессии по линейной части графика [27] с использованием Microsoft Excel 5.0 (Microsoft, Редмонт, Вашингтон, США). Нелинейную регрессию рассчитывали с помощью программы Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA, USA).

Для сравнения концентраций H 2 или ацетата во время фаз подавления был рассчитан односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) [27] на наличие или отсутствие нитрата в качестве тестируемого фактора.Чтобы сравнить скорость производства CH 4 и скорость потребления нитрата, ацетата, H 2 или пропионата, мы выполнили двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA [27] с обработками и временем в качестве факторов. Поскольку данные были повторными измерениями, дисперсионный анализ был скорректирован с использованием метода Greenhouse – Greenberg. Когда общий дисперсионный анализ был значимым, мы сравнивали методы лечения с использованием теста Шеффе. ANOVA были рассчитаны с использованием Statistica for Windows 5.1 (Statsoft, Tulsa, OK, USA).

3 Результаты

3.1 Почвенные пульпы без добавления метаногенных прекурсоров

Добавление нитрата к метаногенной рисовой суспензии полностью остановило производство CH 4 (Рис. 1; Таблица 1). Подавление продолжалось в течение 14 дней после добавления бескислородного раствора нитрата. В колбах без добавления нитрата парциальное давление H 2 оставалось на уровне (среднее ± стандартное отклонение) 2,8 ± 0,1 Па (дни 21–35) (рис. 1). После добавления нитрата концентрация H 2 упала до 0.8 ± 0,1 Па в микрокосмах почвенного навоза в период подавления. Это была значительно более низкая концентрация H 2 , чем в контрольных колбах (однофакторный ANOVA P <0,05) (рис. 1). В течение этого 14-дневного периода в почвенных суспензиях без добавления NaNO 3 концентрация ацетата оставалась на уровне 67 ± 2,6 мкМ (дни 21–35). Добавление NaNO 3 к этой метаногенной почвенной суспензии снизило концентрацию ацетата, но незначительно ( P > 0.05) до среднего значения 55 ± 2,8 мкМ (21–30 сутки). Пропионат не был обнаружен в этих растворах почвы, ни с добавлением нитрата, ни без него (предел обнаружения = 10 мкМ).

1

Влияние нитратов на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата и пропионата в растворах рисовой почвы. Нитрат добавляли после 21 дня анаэробной инкубации. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами.Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

1

Влияние нитратов на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата и пропионата в суспензиях рисовой почвы. Нитрат добавляли после 21 дня анаэробной инкубации. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

1

Скорость образования метана в суспензиях почвы рисовых полей после добавления нитрата и ацетата, H 2 или пропионата

3 a (0,8)
Обработки Производство CH 4 (мкмоль день -1 ) Ингибирование (дни) Ингибирование (%) Потребление нитратов (мкмоль день -1 ) Потребление ацетата (мкмоль день -1 ) Потребление водорода (мкмоль день -1 ) Пропионат расход (мкмоль сутки −1 )
Контроль 11.5 b (0,3)
Контроль + нитрат 0,0 a (0,1) 14 99,2 14 99,2
Ацетат 61,2 c (2,9) 34,4 a (9,5) 3 99,6 58,0 b (4,3) 62,9 a (7,5)
Водород 14,9 9040 b (0,5) 26,6 a (17,2)
Водород + нитрат 0,6 a (0,2) 9 96,2 .3) 39,4 a (9,6)
Пропионат 15,8 b (0,6) 8,1
Пропионат + нитрат 1,2 a (0,3) 6 92,4 33,6 a b (6,5) 17,6 a (4.8)
3 a (0,8)
Обработки CH 4 продукция (мкмоль день -1 ) Ингибирование (дни) Ингибирование (%) Расход нитратов (мкмоль день -1 ) Расход ацетата (мкмоль день -1 ) Потребление водорода (мкмоль день -1 ) Расход пропионата (мкмоль день -1 )
Контроль 11.5 b (0,3)
Контроль + нитрат 0,0 a (0,1) 14 99,2 14 99,2
Ацетат 61,2 c (2,9) 34,4 a (9,5) 3 99,6 58,0 b (4,3) 62,9 a (7,5)
Водород 14,9 9040 b (0,5) 26,6 a (17,2)
Водород + нитрат 0,6 a (0,2) 9 96,2 .3) 39,4 a (9,6)
Пропионат 15,8 b (0,6) 8,1
Пропионат + нитрат 1,2 a (0,3) 6 92,4 33,6 a b (6,5) 17,6 a (4.8)
1

Скорость образования метана в суспензиях почвы рисовых полей после добавления нитрата и ацетата, H 2 или пропионата

3 a (0,8)
Обработки Производство CH 4 (мкмоль в день -1 ) Ингибирование (дни) Ингибирование (%) Потребление нитратов (мкмоль день -1 ) Потребление ацетата (мкмоль день -1 ) Потребление водорода (мкмоль день — 1 ) Расход пропионата (мкмоль день −1 )
Контроль 11.5 b (0,3)
Контроль + нитрат 0,0 a (0,1) 14 99,2 14 99,2
Ацетат 61,2 c (2,9) 34,4 a (9,5) 3 99,6 58,0 b (4,3) 62,9 a (7,5)
Водород 14,9 9040 b (0,5) 26,6 a (17,2)
Водород + нитрат 0,6 a (0,2) 9 96,2 .3) 39,4 a (9,6)
Пропионат 15,8 b (0,6) 8,1
Пропионат + нитрат 1,2 a (0,3) 6 92,4 33,6 a b (6,5) 17,6 a (4.8)
3 a (0,8)
Обработки CH 4 продукция (мкмоль день -1 ) Ингибирование (дни) Ингибирование (%) Расход нитратов (мкмоль день -1 ) Расход ацетата (мкмоль день -1 ) Потребление водорода (мкмоль день -1 ) Расход пропионата (мкмоль день -1 )
Контроль 11.5 b (0,3)
Контроль + нитрат 0,0 a (0,1) 14 99,2 14 99,2
Ацетат 61,2 c (2,9) 34,4 a (9,5) 3 99,6 58,0 b (4,3) 62,9 a (7,5)
Водород 14,9 9040 b (0,5) 26,6 a (17,2)
Водород + нитрат 0,6 a (0,2) 9 96,2 .3) 39,4 a (9,6)
Пропионат 15,8 b (0,6) 8,1
Пропионат + нитрат 1,2 a (0,3) 6 92,4 33,6 a b (6,5) 17,6 a (4.8)

В растворах почвы без нитратов не обнаружено ни нитратов, ни промежуточных продуктов денитрификации (нитрит, NO, N 2 O) (рис. 2). В растворах почвы, в которые добавляли нитрат, нитрат уменьшался со скоростью 20,2 мкмоль колба -1 день -1 (дни 21-27) (Таблица 1). Нитрит, NO и N 2 O временно накапливались до 35 мкМ в день -1 , 0,3 и 20 Па, соответственно, и впоследствии снова потреблялись (рис. 2).Все промежуточные продукты были полностью сокращены в течение периода, в течение которого было подавлено производство CH 4 .

2

Концентрации нитратов и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 S.D.

2

Концентрации нитратов и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

3.2 Влияние ацетата на подавление образования метана нитратами

Добавление ацетата к метаногенной рисовой суспензии значительно стимулировало производство CH 4 (61.Колба 2 мкм -1 сутки -1 ; 21–24 дни) по сравнению с предыдущим контролем (рис. 3; таблица 1). Добавленный ацетат израсходован со скоростью 34,4 мкмоль колба -1 день -1 . Это не предотвратило подавление продукции CH 4 после добавления нитрата (рис. 3). Период подавления был сокращен до 3 дней, что почти в пять раз короче, чем в растворах почвы без ацетата. В течение этого периода подавления парциальное давление H 2 в колбах с ацетатом и нитратом значительно снизилось до 0.8–1,0 Па на 22–23 дни (однофакторный дисперсионный анализ P <0,05) по сравнению с колбами с добавлением только ацетата (2,1 ± 0 Па). Когда добыча CH 4 возобновилась, мы также наблюдали увеличение парциального давления H 2 . Добавленный ацетат первоначально израсходовался со скоростью 34,4 мкмоль колба -1 день -1 и 62,9 мкмоль колба -1 день -1 (дни 21-24) без добавления нитрата или с добавлением нитрата, соответственно (Таблица 1 ). Разница в показателях не была статистически значимой.Пропионат временно накапливается в почвенных растворах с добавкой нитратов и без них. Однако накопление пропионата было больше (100 мкМ) и длилось дольше (17 дней) в растворах почвы с добавлением нитрата, чем без него (60 мкМ, 9 дней) (рис. 3).

3

Влияние добавок ацетата на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата и пропионата в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата.Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

3

Влияние добавок ацетата на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата и пропионата в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 S.D.

Нитраты уменьшались намного быстрее в суспензиях почвы с добавлением ацетата (колба 58,0 мкмоль -1 день -1 ), чем в контрольных растворах без добавки ацетата (рис. 2 и 4). И снова нитрит, NO и N 2 O накапливались временно. Период, в течение которого накапливались все оксиды азота, был намного короче в присутствии, чем в отсутствие дополнительного ацетата (рис. 4). Максимальные наблюдаемые концентрации составляли 70 мкМ, 0,2 и 40 Па, для нитрита, NO и N 2 O соответственно (рис.4). В общем, добавление ацетата увеличивало общую скорость денитрификации.

4

Влияние добавок ацетата на концентрацию нитрата и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 S.D.

4

Влияние добавок ацетата на концентрацию нитрата и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

3.3 Влияние водорода на подавление образования метана нитратами

Добавление одного только H 2 слегка стимулировало продукцию CH 4 в аноксичных растворах рисовой почвы (рис.5) по сравнению с суспензиями без добавки донора электронов (таблица 1). Тем не менее, H 2 не смягчил подавление продукции CH 4 нитратом (Таблица 1). Подавление длилось 9 дней, в течение которых H 2 оставалось практически постоянным (рис. 5). Впоследствии большая часть H 2 была израсходована между 10 и 15 днями после добавления H 2 , независимо от присутствия или отсутствия нитрата (рис. 5).

5

Влияние добавок водорода на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрацию ацетата в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов.Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

5

Влияние добавок водорода на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрацию ацетата в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 S.D.

Нитрат уменьшился со скоростью 25,4 мкмоль колба -1 день -1 (дни 21-30) в суспензиях с добавлением H 2 (Таблица 1). Нитрит накапливался до 30 мкМ, а NO и N 2 O соответственно до 0,5 и 10 Па (рис. 6).

6

Влияние добавок водорода на концентрацию нитратов и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов.Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

6

Влияние добавок водорода на концентрацию нитратов и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами.Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

3,4 Влияние пропионата на подавление образования метана нитратами

Добавление пропионата, более отдаленного метаногенного предшественника, немного стимулировало скорость продукции CH 4 в аноксичных суспензиях рисовой почвы (15,8 мкмоль колба -1 день -1 ) (Рис. 7; Таблица 1). Однако пропионат не уменьшал подавление образования CH 4 после добавления нитрата (таблица 1).Подавление длилось 7 дней. Во время этой фазы парциальное давление H 2 снизилось до 0,5–1,0 Па после добавления нитрата, что было значительно (однофакторный дисперсионный анализ P <0,01) ниже, чем 3,1 ± 0,0 Па, измеренные в колбах, к которым нитрат не добавлялся. Когда метаногенез возобновился, парциальное давление H 2 в колбах, обработанных нитратами, вернулось к значениям, аналогичным значениям для почвы без нитратов.

7

Влияние добавок пропионата на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата и пропионата в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата.Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

7

Влияние добавок пропионата на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата и пропионата в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитратов. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 S.D.

По сравнению с контрольными суспензиями добавление пропионата (фиг. 7) немного увеличило концентрацию ацетата до 144 ± 4 мкМ (фиг. 1). Интересно, что концентрация ацетата в почвенных навозах, к которым добавляли нитрат, увеличивалась до 500 мкМ во время фазы подавления метаногенеза (рис. 7). Когда метаногенез возобновился, концентрация ацетата снова снизилась примерно до 150 мкМ. Однако концентрации ацетата неоднократно менялись в почвах, обработанных пропионатом, как в присутствии, так и в отсутствие нитратов по причинам, которые не могли быть идентифицированы (рис.7).

Пропионат потреблялся быстрее с добавлением нитрата (колба 17,6 мкм, -1 день -1 ), чем без него (колба 8,1 мкмоль -1 день -1 ) между 21 и 27 днями, но разница была статистически не значимо (таблица 1). После истощения нитрата концентрация пропионата оставалась относительно постоянной (2,5 мМ) до 17-го дня инкубации, когда потребление пропионата возобновилось (рис. 7).

Добавленный нитрат израсходован 33.Колба 6 мкм -1 день -1 , когда добавляли пропионат (таблица 1). Весь добавленный нитрат был истощен в течение 6 дней (рис. 8). Этот период соответствовал прекращению производства CH 4 , а также начальному потреблению пропионата. В течение этой фазы нитрит накапливался до 150 мкМ, NO — до 0,3 Па, а N 2 O — до 80 Па (рис. 8).

8

Влияние добавок пропионата на концентрацию нитрата и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата.Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

8

Влияние добавок пропионата на концентрацию нитратов и промежуточных продуктов денитрификации (NO 2 , NO, N 2 O) в суспензиях рисовой почвы с добавлением и без добавления нитрата. Пунктирная линия указывает время, когда возобновился метаногенез при обработке нитратами.Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

3,5 Влияние различных концентраций нитратов на производство метана

Мы также измерили влияние различных концентраций нитратов на подавление продукции CH 4 в анаэробных растворах рисовой почвы (рис. 9). Увеличение концентрации нитрата привело к более длительному периоду подавления и снижению скорости образования метана после полного восстановления нитрата, но не к более высоким скоростям восстановления нитрата выше 2 мМ нитрата (рис.9, таблица 2). Продолжительность периода подавления была достоверно ( P <0,05) и положительно коррелировала ( r = 0,999) с применяемой концентрацией NO 3 . Линейная регрессия периода (в днях) подавления продукции CH 4 от применяемой концентрации нитрата показала, что на каждый миллимоль нитрата, добавленного в почву, продукция CH 4 подавлялась в среднем на 2,8 дня. Хотя скорость образования CH 4 после фазы подавления была значительной ( P <0.05) ниже с повышением концентрации нитратов, они не были достоверно коррелированы ( P > 0,05) с повышенными концентрациями нитратов ( r = -0,86) (Таблица 2). Однако регрессия второго порядка скорости образования метана на концентрацию нитратов ( y = 7,00–1,18 x +0,08 x 2 ) была значительной ( r = −0,969, P <0,05). ).

9

Влияние различных концентраций нитратов на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрации ацетата в растворах рисовой почвы.Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

9

Влияние различных концентраций нитратов на парциальные давления CH 4 и H 2 , а также на концентрацию ацетата в растворах рисовой почвы. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

2

Подавление метаногенеза с увеличением концентрации нитратов

NO 3 концентрация (мМ) Ингибирование (дни) продукция CH 4 (мкмоль день -1 ) Ингибирование ( %) Расход нитратов (мкмоль сутки −1 )
0 0 7.4 a (0,5) 0,0 0,0 a (0,0)
1 2 5,8 b (0,4) 21,4 12,7 b (2,1) [дни 38-40]
2 6 4,3 c (0,3) 41,8 22,7 c (2,7) [дни 38-40]
5 14 3,5 d (0,2) 47,9 29.6 c (7,5) [38–44 дней]
10 28 2,8 e (0,3) 62,3 25,2 c (1,8) [38–55 дней]
NO 3 концентрация (мМ) Ингибирование (дни) CH 4 продукция (мкмоль день -1 ) Ингибирование (%) Расход нитратов (мкмоль день -1 )
0 0 7.4 a (0,5) 0,0 0,0 a (0,0)
1 2 5,8 b (0,4) 21,4 12,7 b (2,1) [дни 38-40]
2 6 4,3 c (0,3) 41,8 22,7 c (2,7) [дни 38-40]
5 14 3,5 d (0,2) 47,9 29.6 c (7,5) [38–44 дней]
10 28 2,8 e (0,3) 62,3 25,2 c (1,8) [38–55 дней]
2

Подавление метаногенеза с увеличением концентрации нитратов

NO 3 концентрация (мМ) Ингибирование (дни) CH 4 продукция (мкмоль день -1 ) Ингибирование (%) Расход нитратов (мкмоль сутки -1 )
0 0 7.4 a (0,5) 0,0 0,0 a (0,0)
1 2 5,8 b (0,4) 21,4 12,7 b (2,1) [дни 38-40]
2 6 4,3 c (0,3) 41,8 22,7 c (2,7) [дни 38-40]
5 14 3,5 d (0,2) 47,9 29.6 c (7,5) [38–44 дней]
10 28 2,8 e (0,3) 62,3 25,2 c (1,8) [38–55 дней]
NO 3 концентрация (мМ) Ингибирование (дни) CH 4 продукция (мкмоль день -1 ) Ингибирование (%) Расход нитратов (мкмоль день -1 )
0 0 7.4 a (0,5) 0,0 0,0 a (0,0)
1 2 5,8 b (0,4) 21,4 12,7 b (2,1) [дни 38-40]
2 6 4,3 c (0,3) 41,8 22,7 c (2,7) [дни 38-40]
5 14 3,5 d (0,2) 47,9 29.6 c (7,5) [38–44 дней]
10 28 2,8 e (0,3) 62,3 25,2 c (1,8) [38–55 дней]

Сразу после добавления нитрата к метаногенным растворам почвы парциальное давление H 2 упало (рис. 9). Парциальное давление H 2 снижалось до 0,1 Па при добавлении 5 или 10 мМ нитрата. Однако парциальное давление H 2 оставалось низким (ниже 1 Па) в течение гораздо более длительного периода при нанесении 10 мМ (28 дней), чем при применении 5 мМ (10 дней).При самых низких концентрациях нитратов (1 и 2 мМ) парциальное давление H 2 лишь ненадолго снизилось ниже или на 1 Па, чтобы вернуться в течение нескольких дней примерно до 2–3 Па. Концентрации ацетата варьировались от 10 до 100 мкМ без каких-либо изменений. закономерность, связанная с добавленными концентрациями нитратов.

Концентрации нитратов, нитритов и NO были измерены в суспензии почвы (рис. 10). Начальные скорости восстановления нитратов значительно увеличиваются с увеличением исходных концентраций нитратов до 2 мМ (Таблица 2).При концентрациях выше 2 мМ скорости восстановления нитратов существенно не отличались друг от друга. Связь между скоростью восстановления нитратов и концентрацией нитратов нелинейная ( y = 2,60 + 9,70 x −0,75 x 2 ) со значительным ( P <0,01) r = 0,973 . Накопление нитритов и NO было выше в почве, в которую были добавлены более высокие концентрации нитратов. Период накопления нитрита и NO был больше при применении более высоких концентраций нитратов (рис.10).

10

Промежуточные продукты нитратов и денитрификации (NO 2 , NO) в суспензиях рисовой почвы с добавлением нитратов различной концентрации. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 стандартное отклонение.

10

Промежуточные продукты нитратов и денитрификации (NO 2 , NO) в суспензиях рисовой почвы с добавлением нитратов различной концентрации. Точки данных являются средними для повторяющихся колб, а столбики ошибок представляют ± 1 S.Д.

4 Обсуждение

4.1 Влияние нитратов на метаногенные прекурсоры

Как уже упоминалось, было предложено несколько гипотез для объяснения механизма подавления образования CH 4 после добавления нитрата. Согласно гипотезе конкуренции, денитрифицирующие бактерии будут снижать точку компенсации концентраций H 2 и ацетата ниже порогового значения, необходимого для активности метаногенов [9,11,12].В установившихся условиях мы обнаружили, что парциальное давление H 2 значительно упало с примерно 3 Па до менее 1 Па, независимо от того, какая концентрация нитрата применялась. Аналогичное падение парциального давления H 2 наблюдалось также при добавлении ацетата или пропионата вместе с нитратом. Напротив, добавление нитрата не привело к значительному снижению концентрации ацетата. Ацетат даже увеличивался во время фазы подавления, когда пропионат добавлялся вместе с нитратом.Такое увеличение можно объяснить повышенным образованием ацетата после разложения пропионата. Эти результаты, а также те, которые уже сообщались в другом месте для другой почвы рисовых полей [7], предполагают, что конкуренция может быть механизмом, вовлеченным в подавление гидрогенотрофного метаногенеза, но очень маловероятно вовлечена в подавление уксусно-пластического метаногенеза.

4.2 Влияние метаногенных прекурсоров

Другой подход к проверке, верна ли гипотеза конкуренции для объяснения подавления любого метаногенного пути в суспензиях рисовой почвы, заключается в измерении воздействия непосредственных (H 2 , ацетат) метаногенных прекурсоров на эффект подавления нитратов.Если основным механизмом является конкуренция за субстрат, следует ожидать частичного облегчения подавления выработки CH 4 после добавления либо ацетата, либо H 2 , а также, возможно, пропионата, предшественника H 2 . и ацетат [28]. Однако такие эксперименты (рис. 3, 5 и 7) продемонстрировали, что добавление ацетата, H 2 или пропионата, хотя и стимулирует метаногенез в каждом случае при добавлении отдельно, не снимает подавления, вызванного добавлением нитрата.Хотя можно утверждать, что небольшое увеличение продукции CH 4 было измерено во время ингибирования при добавлении H 2 или пропионата, это увеличение было очень небольшим и, кроме того, не статистически значимым (Таблица 1). Это убедительное доказательство того, что конкуренция не была основным механизмом, участвующим в подавлении уксусно-пластического метаногенеза нитратами. Такой же вывод можно сделать для гидрогенотрофного пути, хотя снижение парциального давления H 2 в присутствии нитрата (как уже обсуждалось в предыдущем разделе), кажется, противоречит этому выводу.Однако метаногенез в любом случае может ингибироваться токсичными промежуточными продуктами денитрификации, тогда как H 2 потребляется денитрифицирующими бактериями, имеющими более низкий порог H 2 , чем метаногены [29]. Добавленный H 2 расходуется быстрее в присутствии, чем в отсутствие нитрата, а нитрат расходуется быстрее в присутствии, чем в отсутствие экзогенного H 2 (таблица 1), причем обе нормы избытка стехиометрически связаны (см. Ниже ). Кроме того, снижение парциального давления H 2 может быть связано с уменьшением продукции H 2 по тому же механизму, что и ингибирование метаногенеза.Возможно, что ферментативные бактерии, такие как Clostridium spp. участвующие в производстве H 2 , возможно, были чувствительны к оксидам азота, которые временно высвобождались во время денитрификации нитрата. Продукция H 2 из нитрогеназной системы диазотрофа Clostridium pasteurianum ингибировалась как NO, так и нитритом, но не CO [30]. По-видимому, NO ингибировал Fe-белок, разрушая кластер Fe 4 S 4 .Поскольку гидрогеназы, участвующие в продукции H 2 из протонов, также являются белками Fe – S [31], вероятно, что NO действовал аналогичным образом на гидрогеназы, участвующие в продукции H 2 в почве.

4.3 Накопление промежуточных продуктов денитрификации и влияние доноров электронов

Промежуточные продукты денитрификации (NO 2 , NO и N 2 O) все накапливались в разной степени и в течение разного времени в метаногенных суспензиях рисовой почвы после добавления нитрата.Известно, что метаногенные археи чувствительны к оксидам азота как в аксенических культурах, так и в отложениях или рисовой почве [7,19,20]. Оксид азота особенно токсичен для бактериальных клеток, поскольку атакует группы Fe в ферментах [32]. Ряд ферментов, участвующих в уксуснокластическом или гидрогенотрофном пути метаногенных архей, содержат кластеры Fe – S или гемы Fe, такие как корриноид CO дегидрогеназного комплекса, гидрогеназы и цитохромы b 1 и b 2 [5].Эти ферменты могут быть восприимчивы к ингибированию NO или нитритом, которые могут образовывать металло-нитрозильные комплексы [33]. Ферменты, которые имеют решающее значение для метаногенов, также могут ингибироваться N 2 O [34], который, как известно, инактивирует кобаламин-зависимые ферменты. Исходя из этих соображений, неудивительно, что метаногенез возобновлялся только после полного восстановления всех промежуточных продуктов денитрификации.

В наших экспериментах доноров электронов превышало количество, необходимое для полного восстановления нитратной добавки, поскольку не все добавленные доноры электронов были израсходованы для полного восстановления нитрата.Общий эффект добавления доноров электронов заключался в уменьшении периода, в течение которого накапливались промежуточные продукты денитрификации. Поскольку ацетат является наиболее широко используемым источником углерода и энергии для денитрификаторов [35], неудивительно, что добавление ацетата было наиболее эффективным стимулятором денитрификации, за которым следовали пропионат и H 2 . Если мы рассмотрим молярные отношения доноров электронов, необходимые для восстановления 1 моля нитрата, принимая во внимание только часть скорости восстановления нитрата выше той, которая измерена в контрольной почве, мы обнаружили, что 0.Требовалось 75 моль ацетата по сравнению с 2,46 моль H 2 и 0,71 моль пропионата. Предполагая восемь, два и шесть электронов для каждой молекулы ацетата (окисленного до 2 CO 2 ), H 2 (окисленного до H 2 O) и пропионата (окисленного до ацетата + CO 2 ), соответственно, мы обнаружили, что для восстановления одной молекулы нитрата ацетатом, H 2 и пропионатом требовалось 6,0, 4,9 и 4,3 электрона. Эти значения довольно хорошо согласуются с теоретическим соотношением пяти электронов, необходимых для восстановления одной молекулы нитрата до 0.5 молекула N 2 [36]. Скорость денитрификации очень хорошо соответствовала продолжительности подавления продукции CH 4 . Чем выше скорость денитрификации, тем короче фаза подавления денитрификации.

В отличие от добавления метаногенных предшественников, увеличение концентрации нитрата линейно увеличивало продолжительность фазы подавления. Более высокие концентрации нитратов также приводят к значительно более низким дебитам метана после возобновления метаногенеза (рис.9). Такое наблюдение согласуется с гипотезой торможения. Скорость восстановления нитратов значительно увеличилась до 2 мМ, но после этого значительного увеличения скорости восстановления не наблюдалось. Если мы предположим, что гетеротрофные бактериальные популяции (ферментативные бактерии) действовали как поставщики этих доноров электронов, можно сделать вывод, что денитрификаторы зависели от того же источника доноров электронов H 2 , ацетата и пропионата, что и микробное сообщество, продуцирующее CH 4 при отсутствии нитратов.Такая зависимость популяций денитрифицирующих бактерий от анаэробных гетеротрофных бактерий уже была предложена в эмпирическом исследовании пресноводных отложений, показывающем, что лучшей прогностической переменной для объяснения распределения скоростей денитрификации была гетеротрофная активность, измеренная как продукция CO 2 [37]. ]. Таким образом, для объяснения механизма подавления продукции CH 4 в бескислородной почве или отложениях по отношению к денитрификаторам может быть критически важным рассмотреть соотношение между пулом акцепторов электронов и пулом доноров электронов.

В заключение, представленные здесь результаты предполагают, что конкуренция за субстрат между денитрификаторами и метаногенами не является основным механизмом подавления метаногенеза. Вместо этого ингибирование токсичными промежуточными продуктами денитрификации лучше объясняет наши экспериментальные результаты. Соотношение между акцептором электронов и донором электронов, по-видимому, имеет решающее значение для интенсивности ингибирования метаногенеза в бескислородной рисовой почве и может иметь значение для метаногенной среды в целом.

Благодарности

Это исследование было частью Sonderforschungsbereich 395 «Взаимодействие, адаптация и каталитическая способность наземных микроорганизмов». Мы благодарим Роджера Ноулза и Ульрику Боссе за критическое прочтение рукописи.

Список литературы

[1]

(

1996

)

Почвенные микроорганизмы как регуляторы атмосферных микрогазов (H 2 , CO, CH 4 , OCS, N 2 O и NO)

.

Microbiol. Ред.

60

,

609

640

. [2]

(

1993

)

Рисовое сельское хозяйство: выбросы

. В:

Атмосферный метан: источники, поглотители и роль в глобальных изменениях

(Ред.), Стр.

230

253

.

Springer

,

Берлин

. [3]

(

1988

)

Биогеохимические аспекты атмосферного метана

.

Global Biogeochem.Циклы

2

,

299

327

. [4]

(

1994

)

Глобальная химия атмосферы и биосферы

. В:

Глобальная химия атмосферы и биосферы

(ред.), Стр.

1

18

.

Пленум

,

Нью-Йорк

. [5]

(

1996

)

Пути сохранения энергии у метаногенных архей

.

Arch. Microbiol.

165

,

149

163

.[6]

(

1992

)

Метан из ацетата

.

J. Bacteriol.

174

,

5489

5495

. [7]

(

1998

)

Влияние нитратов, нитритов, NO и N 2 O на метаногенез и другие окислительно-восстановительные процессы в бескислородной почве рисовых полей

.

FEMS Microbiol. Ecol.

25

,

301

318

. [8]

(

1997

)

Раннее начало образования метана в бескислородной рисовой почве, несмотря на присутствие окислителей

.

FEMS Microbiol. Ecol.

24

,

311

320

. [9]

(

1995

)

Конкуренция за доноры электронов среди восстановителей нитратов, восстановителей трехвалентного железа, сульфатредукторов и метаногенов в бескислородной рисовой почве

.

Biol. Fertil. Почвы

19

,

65

72

. [10]

(

1995

)

Роль межвидовых H 2 Передача сульфатным и железоредуцирующим бактериям в потреблении ацетата в бескислородной рисовой почве

.

FEMS Microbiol. Ecol.

16

,

61

69

. [11]

(

1982

)

Кинетический анализ конкуренции между сульфатредукторами и метаногенами за H 2 в отложениях

.

заявл. Environ. Microbiol.

43

,

1373

1379

. [12]

(

1985

)

Минимальный порог водородного обмена у метаногенных бактерий

.

заявл. Environ. Microbiol.

49

,

1530

1531

. [13]

(

1991

)

Диссимиляционные Fe (III) и Mn (IV)

.

Microbiol. Ред.

55

,

259

287

. [14]

(

1985

)

Взаимодействие между метаногенными и сульфатредуцирующими бактериями в отложениях

.

Adv. Акват. Microbiol.

3

,

141

179

.[15]

(

1987

)

Конкурентные механизмы ингибирования сульфатредукции и образования метана в зоне восстановления трехвалентного железа в отложениях

.

заявл. Environ. Microbiol.

53

,

2636

2641

. [16]

(

1973

)

Ингибирование образования метана в почве различными азотсодержащими соединениями

.

Soil Biol. Biochem.

5

,

673

678

.[17]

(

1993

)

Влияние окислительно-восстановительного потенциала на метаногенез Methanosarcina barkeri

.

Arch. Microbiol.

160

,

108

113

. [18]

(

1994

)

Восстановление нитратов анаэробным илом с использованием глюкозы при различных концентрациях нитратов — аммификация, денитрификация и метаногенная активность

.

Environ. Technol.

15

,

41

49

. [19]

(

1976

)

Ингибирование метаногенеза в отложениях солончаков и цельноклеточных суспензиях метаногенных бактерий оксидами азота

.

заявл. Environ. Microbiol.

32

,

264

269

. [20]

(

1998

)

Ингибирующее действие нитратов, нитритов, NO и N 2 O на метаногенез Methanosarcina barkeri и Methanobacterium bryantii

.

FEMS Microbiol. Ecol.

25

,

331

339

. [21]

(

1967

)

Влияние нитратов и закиси азота на накопление водорода и метана в анаэробно инкубированных почвах

.

Растительная почва

27

,

357

368

. [22]

(

1995

)

Промежуточный метаболизм в метаногенной рисовой почве и влияние температуры

.

FEMS Microbiol. Ecol.

18

,

85

102

. [23]

(

1981

)

Денитрификация

.

John Wiley

,

New York

. [24]

(

1987

)

Температурное ограничение водооборота и метаногенеза в бескислородной рисовой почве

.

FEMS Microbiol. Ecol.

45

,

281

289

. [25]

(

1980

)

Полевые измерения потерь азота удобрений в атмосферу в виде закиси азота

.

Атмос. Environ.

14

,

555

558

. [26]

(

1991

)

Метаболизм оксида азота в почве и денитрифицирующие бактерии

.

FEMS Microbiol. Ecol.

85

,

81

93

. [27]

(

1981

)

Биометрия

, 2-е изд.

W.H. Freeman

,

New York

. [28]

(

1997

)

Оборот пропионата в метаногенной рисовой почве

.

FEMS Microbiol. Ecol.

23

,

107

117

. [29]

(

1988

)

Способность гидрогенотрофных анаэробных бактерий конкурировать за следы водорода зависит от окислительно-восстановительного потенциала концевого акцептора электронов

.

Arch. Microbiol.

149

,

350

357

. [30]

(

1981

)

Сравнение оксида углерода, оксида азота и нитрита как ингибиторов нитрогеназы из Clostridium pasteurianum

.

Arch. Biochem. Биофиз.

210

,

246

256

. [31]

(

1979

)

Механизмы ферментативных реакций

.

W.H. Freeman

,

Сан-Франциско

. [32]

(

1992

)

НЕТ новостей — хорошая новость

.

Наука

258

,

1862

1865

. [33]

(

1993

)

Биологическая роль оксида азота в бактериях

.

Arch. Microbiol.

160

,

253

264

. [34]

(

1990

)

Метаногенез из ацетата в клеточных экстрактах Methanosarcina barkeri : изотопный обмен между CO 2 и карбонильной группой ацетил-КоА и роль H 2

.

Arch. Microbiol.

153

,

156

162

. [35]

(

1997

)

Численно доминирующие денитрифицирующие бактерии из мировых почв

.

заявл. Environ. Microbiol.

33

,

926

939

. [36]

(

1977

)

Введение в микробиологию почвы

.

John Wiley

,

New York

. [37]

(

1994

)

Денитрификация и образование метана в отложениях гавани Гамильтон (Канада)

.

Microb. Ecol.

27

,

123

141

.

Заметки автора

© 1999 Федерация европейских микробиологических обществ. Опубликовано Elsevier Science B.V.Все права защищены.

границ | Сдвиги метаболизма водорода от метаногенеза к производству пропионата в ответ на замену кормовой клетчатки на источники волокна не кормовой в рационе in vitro

Введение

Микроорганизмы в рубце могут сбраживать корма, богатые целлюлозой, и могут преобразовывать растительные материалы, которые люди не могут использовать напрямую, в мясо и молочные продукты.В то же время процесс гидролиза комплексных соединений сопровождается образованием газов, таких как водород (H 2 ) и диоксид углерода (CO 2 ). Чтобы ферментация продолжалась, метаногенные археи в рубце производят метан (CH 4 ), используя H 2 и CO 2 для удаления H 2 и поддержания парциального давления H 2 на низком уровне (Moss et al. др., 2000). Метаногенез от жвачных животных может привести к значительной потере эффективности корма (2–12%), в зависимости от типа рациона (Johnson and Johnson, 1995).Для смягчения негативного воздействия на изменение климата и повышения эффективности кормов были реализованы различные стратегии по снижению выбросов CH 4 от жвачных животных, в том числе с использованием эфирных масел (Patra and Yu, 2012), растительных экстрактов (Wang et al., 2016), ионофоры (Weimer et al., 2008) и вакцины (Williams et al., 2009). Однако экосистема рубца чрезвычайно сложна, и способность этой системы эффективно преобразовывать сложные углеводы в летучие жирные кислоты (ЛЖК) частично объясняется эффективным удалением H 2 за счет снижения CO 2 с образованием CH 4 .Метаногенез можно подавить на короткие периоды, но экология системы такова, что она часто возвращается к исходным уровням производства метана с помощью всех различных адаптивных механизмов (McAllister and Newbold, 2008). С другой стороны, проблема с химическими остатками, токсичностью и высокой стоимостью значительно ограничила использование этих стратегий в животноводстве.

Тип корма, предлагаемого жвачным животным, имеет большое влияние на профиль ЛЖК и уровень производства метана.Кессель и Рассел (1996) сообщили, что производство метана полностью подавлялось при pH менее 6,0 при кормлении высококонцентрированной диетой. Однако, когда микроорганизмы в рубце подвергаются воздействию большого количества ферментируемых субстратов в течение коротких периодов времени, скорость производства ЛЖК превысит использование ЛЖК, что приведет к подострому ацидозу рубца или острому ацидозу рубца, что отрицательно сказывается на здоровье и продуктивности животных ( Нагараджа и Титгемейер, 2007; Сато, 2015). Источники не кормовых волокон (NFFS) из побочных продуктов с высоким содержанием клетчатки обычно имеют ограниченное применение в рационах нежвачных животных, но диетологи для жвачных животных могут использовать их для частичной замены кормов и концентратов в рационах кормления грудью (Allen and Grant, 2000; Stock et al., 2000). Хотя у них разные производственные реакции (Huhtanen, 1993; Huhtanen et al., 1995; Alamouti et al., 2009), диеты на основе NFFS могут поддерживать или улучшать продуктивность молочного скота при определенных условиях (Pereira et al., 1999; Ertl et al., 2015). Стратегия первичной замены некоторого количества кормовой клетчатки на NFFS для высокопродуктивных коров и лишь частичной замены крахмала для низкопродуктивных коров может оптимизировать использование питательных веществ и потенциально контролировать затраты на корм без ущерба для здоровья или продуктивности животных (Bradford and Mullins, 2012).Более того, Pereira и Armentano (2000) сообщили, что рационы с низким содержанием кормов и средне-нейтральной детергентной клетчаткой (NDF) (12,6% кормового NDF, 27,5% общего NDF) и рационы с низким содержанием корма и высоким содержанием NDF (12,7% кормового NDF, 35,7%). % общего NDF) имели более низкое соотношение ацетата к пропионату и более высокую долю пропионата, чем традиционный рацион (20,1% кормового NDF, 25,2% общего NDF). Образование ацетата и бутирата приводит к образованию H 2 , который может быть использован для образования CH 4 метаногенными археями (Moss et al., 2000). Пропионат является конечным продуктом ферментации рубца, который, вероятно, является основной альтернативой поглотителю H + после CH 4 , а соотношение ацетата к пропионату в рубце имеет связь с метаногенезом (Lana et al., 1998; Рассел, 1998). Баланс между образованием пропионата и ацетата и бутирата играет ключевую роль в определении H 2 , доступного в рубце для использования метаногенными археями. Янссен (2010) сообщил, что увеличение образования пропионата тесно связано с уменьшением производства CH 4 .В метаанализе Унгерфельд (2015) обнаружил, что ингибирование продукции CH 4 в периодических культурах приводит к перенаправлению метаболического водорода в сторону пропионата и H 2 , но не бутирата. Кроме того, пропионат преимущественно используется в качестве предшественника глюкозы у жвачных животных, и образование большего количества пропионата, вероятно, приведет к более эффективному использованию энергии корма. Максимальное увеличение потока метаболического водорода в рубце от CH 4 к VFA (в основном пропионату) повысит эффективность производства жвачных животных и снизит их воздействие на окружающую среду (Ungerfeld, 2015).Следовательно, модификация диетического состава с помощью NFFS может быть эффективной мерой для смещения потока водорода в сторону альтернативных акцепторов электронов, таких как пропионат.

Целью этого исследования было построение модели метаболических водородных сдвигов in vitro для изучения влияния замены фуражной клетчатки NFFS в рационах на метаногенез, водородный метаболизм, производство пропионата и метаногенное и бактериальное сообщество с помощью высокопроизводительного секвенирования. .

Материалы и методы

Схема эксперимента и

in vitro Инкубация

Полностью рандомизированный дизайн был применен в инкубации in vitro для исследования влияния замены кормовой клетчатки NFFS в рационах на ферментацию рубца, метаногенез и метаногенное и бактериальное сообщество.В текущем исследовании используются два вида лечения: CON (базовый общий смешанный рацион) и TRT (модифицированный общий смешанный рацион). Диетические обработки были достигнуты путем частичной замены кормовых волокон NFFS (пшеничные отруби и соевые бобы) с целью снижения содержания нейтрального детергентного волокна в кормах (fNDF) с 24,0 до 15,8%, при этом состав и степень включения других диетических ингредиентов остались прежними. в общих смешанных пайках (TMR) (Таблица 1).

ТАБЛИЦА 1. Состав и уровни питательных веществ экспериментальных субстратов.

Комитет по уходу и использованию животных Китайской академии сельскохозяйственных наук (Пекин, Китай) одобрил процедуры, используемые для сбора рубцовой жидкости от животных-доноров. Рубцовую жидкость для инкубации in vitro собирали у трех лактирующих коров голштинской породы с канюлированными рубцами через 2 часа после утреннего кормления; животных кормили TMR два раза в день. Рубцовую жидкость доставили в лабораторию в течение 30 мин и отфильтровали через слои марли при непрерывной промывке CO 2 .Равные объемы жидкости рубца, собранной у каждой из коров, объединяли в качестве инокулята и разбавляли буферным раствором (1: 2 об. / Об.), Который был приготовлен, как описано (Menke, 1988), при 39 ° C с непрерывным потоком. CO 2 в течение 3–5 с для удаления воздуха из свободного пространства. Смесь инокулят-буфер разливали во флаконы для сыворотки емкостью 120 мл (75 мл / флакон), содержащие 500 мг субстратов TMR (CON или TRT). Еще три бутылки без субстрата служили заготовками. После того, как они были запечатаны бутилкаучуком и гофрированными алюминиевыми уплотнениями, все флаконы с сывороткой были соединены с вакуумированными воздушными мешками и инкубированы при 39 ° C в течение 48 часов с горизонтальным встряхиванием при 60 об / мин.Инкубацию in vitro с повторяли в трех экспериментальных партиях, и в каждой партии проводили по три ферментации на обработку.

Отбор проб и анализ биогаза и ЛЖК

В конце 48 ч инкубации общее газообразование каждого воздушного мешка измеряли с помощью калиброванных стеклянных шприцев объемом 100 мл (Häberle Labortechnik, Lonsee-Ettlenschieß, Германия), а внутреннюю стенку покрывали вазелином. Значения pH инкубации in vitro измеряли с помощью портативного pH-метра (портативный pH-метр Seven Go TM , Mettler Toledo, Швейцария).Весь материал биомассы в каждой бутылке индивидуально фильтровали через предварительно взвешенные нейлоновые мешки (8 см × 12 см, 42 мкм). Отфильтрованные образцы инкубационной жидкости (2,5 мл) по отдельности собирали в микроцентрифужные пробирки и хранили при -80 ° C для ЛЖК и микробиологического анализа. После этого нейлоновые мешки были осторожно промыты холодной проточной водой до тех пор, пока стоки не станут прозрачными, а затем они были высушены при 55 ° C в течение 48 часов до достижения постоянного веса для анализа сухого вещества (DMD), нейтрального моющего волокна (NDFD). и исчезновение кислотно-детергентного волокна (ADFD).Содержание NDF и ADF определяли с помощью анализатора волокон Ankom A200 (Ankom Technology, Македон, Нью-Йорк, США) на основе процедур Van Soest et al. (1991) с использованием α-амилазы и сульфида натрия для NDF.

Концентрации метана и водорода в пробах газа определяли с помощью газового хроматографа (7890B, Agilent Technologies, США), оборудованного детектором теплопроводности и насадочной колонкой (Porapak Q, Agilent Technologies, США).Начальную температуру печи поддерживали на уровне 30 ° C и выдерживали при этой температуре в течение 1,5 мин, и реакция продолжалась в течение 1,5 мин. Температура детектора составляла 100 ° C, газ-носитель — азот. Объем добычи газа (общий газ, CH 4 и H 2 ) был скорректирован с учетом условий температуры (25 ° C) и давления (101,325 кПа). Производство метана и водорода рассчитывалось на основе концентрации метана и водорода и общего производства газа. Концентрации ЛЖК в культурах также анализировали с помощью газового хроматографа (7890B, Agilent Technologies, США), снабженного пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой (30 м × 0.250 мм × 0,25 мкм; BD-FFAP, Agilent Technologies, США). Первоначальная температура печи поддерживалась на уровне 90 ° C, увеличивалась на 5 ° C / мин до 120 ° C, выдерживалась при этой температуре в течение 2 минут, и реакция продолжалась в течение 8 минут. Затем температуру повышали на 20 ° C / мин до 250 ° C и выдерживали при этой температуре в течение 10 минут, и реакция продолжалась в течение 24,5 минут. Температура инжектора составляла 250 ° C, температура детектора — 280 ° C, газ-носитель — азот.

Экстракция ДНК

Микробную ДНК экстрагировали с использованием набора для экстракции (E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit, Omega, Norcross, Georgia, United States) в трех экземплярах в соответствии с инструкциями производителя, и полученные экстракты были составлены для усреднения систематической ошибки при отборе проб и экстракции. Концентрацию и качество экстрагированной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и спектрометра Qubit 3.0 (Invitrogen, США) соответственно.

Микробная амплификация генов 16S рРНК и секвенирование Illumina

Область V4 гена 16S рРНК бактерий и архей амплифицировали с использованием универсальных праймеров 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 ‘) и 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) (Caporaso et al., 2011) с прямыми праймерами, помеченными уникальными последовательностями штрих-кода для каждого образца. Хотя численность сообщества архей была намного ниже по сравнению с сообществом бактерий, сообщество архей было особенно проанализировано с помощью вложенной ПЦР. В подходе вложенной ПЦР специфическое сообщество архей было сначала амплифицировано с использованием праймеров Arch440F (5’-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3 ‘) и Arch2000R (5′-GAGARGWRGTGCATGGCC-3’), как описано Gantner et al. (2011), а затем продукт ПЦР использовали в качестве матрицы во второй ПЦР с использованием праймеров Arch449F (5′-GYGCASCAGKCGMGAAW-3 ′) и Arch806R (50-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3 ′) (Takai and Horikoshi, 2000).30 мкл реакционной смеси для ПЦР содержали 15 мкл 2 × Taq Master Mix, 1 мкл 10 мкМ праймера F Bar-PCR, 1 мкл 10 мкМ Primer R и 10–20 нг матрицы геномной ДНК. ПЦР проводили на термоциклере T100 TM (BIO-RAD, США) при следующих условиях: 94 ° C в течение 3 мин; с последующими 5 циклами 94 ° C в течение 30 секунд, 45 ° C в течение 20 секунд и 65 ° C в течение 30 секунд; затем 20 циклов 94 ° C в течение 20 секунд, 55 ° C в течение 20 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд; и закончили окончательной вытяжкой при 72 ° C в течение 5 мин. Праймеры для ПЦР, совместимые с мостиковым мостиком Illumina, были введены в следующий цикл (второй цикл для бактериальной ДНК и третий этап для ДНК архей) ПЦР.Следующий раунд ПЦР проводили при следующих условиях: 95 ° C в течение 3 минут, затем 5 циклов: 94 ° C в течение 20 секунд, 55 ° C в течение 20 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд; и завершение окончательной вытяжкой при 72 ° C в течение 5 мин. ДНК амплифицировали в трех экземплярах для каждого образца, а затем ампликоны ПЦР дополнительно очищали с помощью набора для очистки ДНК (Gel Purification kits, Sangon, Shanghai, China), и концентрации определяли с помощью спектрометрии (Qubit 3.0, Invitrogen, США). Наконец, очищенные ампликоны гена 16S рРНК были объединены и подвергнуты секвенированию парных концов с использованием платформы Illumina MiSeq в Shanghai Sangon Biotech Co., ООО

Обработка и анализ данных секвенирования

Пары считываний исходных фрагментов ДНК сначала были объединены с помощью FLASH (Magoč and Salzberg, 2011), а затем PRINSEQ использовался для контроля качества этих объединенных считываний (Schmieder and Edwards, 2011). Объединенные чтения были назначены каждому образцу на основе уникального штрих-кода. Затем штрих-код и праймеры были удалены. Химеры ПЦР отфильтровывали с помощью UCHIME (Edgar et al., 2011). После вышеупомянутой фильтрации средняя длина всех чистых считываний составляла 416 и 379 п.н., а средняя глубина секвенирования составляла прибл.68 381 и 61 343 чистых чтения для анализа бактериальных и архейных сообществ соответственно. Операционные таксономические единицы (OTU) были сгруппированы по 97% идентичности последовательностей с использованием UPARSE (Edgar et al., 2011). Таксономическая классификация последовательностей была проведена с использованием классификатора Ribosomal Database Project (RDP) при загрузочном отсечении 80%, как было предложено RDP. Для каждого образца рассчитывались индексы Симпсона, Шеннона, Чао1, покрытия и ACE. Взвешенное расстояние UniFrac использовалось для анализа главных координат (PCoA) (Lozupone et al., 2007), а анализ сходства (ANOSIM) в QIIME с 999 перестановками (R Core Team, 2013) был проведен для оценки значительных различий между видами лечения. Относительное количество бактерий выражали в процентах. Разница в относительной численности бактерий и архей выражалась в процентах, и для визуализации разницы был построен график с расширенными полосами погрешностей с помощью программного обеспечения для биоинформатики (STAMP). Был использован двусторонний тест Уэлча, а инвертированный Уэлч составил 0,95 (Parks et al., 2014).

Статистический анализ

Объем добычи газа (общий газ, CH 4 и H 2 ), pH, ЛЖК, DMD, NDFD, ADFD, численность бактерий и индекс разнообразия были проанализированы с использованием PROC MIXED из SAS 9.4 (SAS Institute, Inc., Кэри, Северная Каролина, США), как показано на следующей модели: Y ijk = μ + T i + B j + TB ij + e ijk , где Y ijk — зависимая переменная, μ — общее среднее значение, T i — эффект лечения (CON или TRT, считается фиксированным), B j — эффект партий ( j = 1,2 , 3, считается фиксированным), TB ij — это взаимодействие между T i и B j (считаются фиксированными эффектами), а e ijk — остаток.Данные о численности бактерий были преобразованы в log10 (n + 1) для обеспечения нормального распределения. Остальные данные были проверены на нормальное распределение и однородность с помощью тестов Шапиро-Уилка и Левена в SAS 9.4. Различия были объявлены значимыми при P <0,05 и тенденциями при 0,05 ≤ P <0,10.

Регистрационный номер нуклеотидной последовательности

Все необработанные последовательности были отправлены в архив чтения последовательностей NCBI (SRA) под номером доступа SRP134679.

Результаты

Производство биогаза, разлагаемость, pH и VFA

DMD, NDFD и ADFD значительно увеличились, когда пищевые волокна корма были частично заменены NFFS.Концентрация пропионата была значительно увеличена, в то время как на концентрацию ацетата и отношение ацетата к пропионату обработка не влияла. Добыча общего газа существенно не пострадала в результате обработки, она просто снизилась всего на 6,4%. По сравнению с CON, производство H 2 TRT увеличилось на 8,45% и также не претерпело значительных изменений. Производство CH 4 имело тенденцию к снижению на 14,06%, когда пищевые волокна корма (в основном из люцерны) были частично заменены NFFS (пшеничные отруби и лузга сои) (Таблица 2).

ТАБЛИЦА 2. Влияние замены кормовой клетчатки NFFS в рационах на ферментацию рубца и производство биогаза in vitro ( n = 9).

Разнообразие метаногенных и бактериальных сообществ

Структура сообщества архей и бактерий была охарактеризована путем секвенирования области V4 гена 16S рРНК с помощью Illumina MiSeq.

Архей

После объединения и проверки качества из 18 образцов было сгенерировано в общей сложности 1 182 452 объединенные последовательности и 1 142 612 высококачественных последовательностей со средней длиной считывания 379 полученных оснований.После фильтрации химер оставшиеся 1104189 последовательностей были использованы для создания OTU с 97% сходством последовательностей во всех образцах. Таблица OTU была отфильтрована, оставив 5 163 OTU для дальнейшего анализа. Сообщество архей было представлено двумя разными типами: Euryarchaeota и Thaumarchaeota , где Euryarchaeota составляли в среднем 99,9%. Роды, каждый из которых был представлен ≥0,1% от общего числа последовательностей, были отобраны для дальнейшего анализа.5 преобладающих родов: Methanomassiliicoccus (57,62%), Methanobrevibacter (28,67%), Methanomicrobium (11,36%), Methanobacterium (1,76%) и Methanosphaera.

РИСУНОК 1. Состав преобладающих родов архей среди обработок in vitro . КОН, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и лузгой сои.Показаны 5 наиболее распространенных родов архей, а остальные не показаны ( n = 9).

Индексы альфа-разнообразия сообщества архей были представлены в таблице 3. Никаких существенных различий между обработками на основе количества и охвата OTU не наблюдалось, что указывает на то, что глубина секвенирования была желательной для анализа. На индексы альфа-разнообразия Chao1, ACE, Shannon и Simpson лечение не повлияло, что свидетельствует об уменьшении содержания fNDF с 24.От 0 до 15,8% не изменили богатство и разнообразие сообщества архей. Анализ PCoA на основе взвешенных показателей UniFrac был проведен для сравнения двух методов лечения (рис. 2). Анализ ANOSIM не выявил достоверных различий в структуре сообщества архей между CON и TRT ( R = 0,016, P = 0,304). На главную координату 1, 2 и 3 приходилось 69,4, 19,4 и 5,7% общей вариации соответственно.

ТАБЛИЦА 3. Индексы альфа-разнообразия архей и бактерий среди обработок in vitro ( n = 9).

РИСУНОК 2. Анализ главных координат (PCoA) структур сообщества архей среди обработок in vitro . Графики PCoA были построены с использованием взвешенного метода UniFrac. КОН, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и шелухой сои ( n = 9).

Бактерии

Всего из 18 образцов было сгенерировано 1 1414 889 объединенных последовательностей и 1 367 883 высококачественных последовательностей со средней длиной считывания 416 оснований.После удаления химерных последовательностей оставшиеся 1230862 последовательности были использованы для создания OTU с 97% сходством последовательностей во всех образцах. После фильтрации таблицы OTU 15 542 OTU были оставлены для дальнейшего анализа. Во всех образцах было идентифицировано 19 бактериальных типов. Firmicutes и Bacteroidetes были доминирующими типами, составляя 48,03 и 41,79% от общего числа последовательностей, соответственно. Verrucomicrobia , Actinobacteria и Proteobacteria составляли в среднем 2 процента.74, 1,47 и 1,44% соответственно (рисунок 3). Остальные типы представляют менее 1% всех последовательностей. Роды, каждый из которых был представлен ≥0,1% от общего числа последовательностей, были отобраны для дальнейшего анализа. Среди девяти преобладающих родов были Prevotella (6,59%), Acetobacteroides (3,87%), Falsiporphyromonas (3,60%), Succiniclasticum (3,20%), Sporobacter_ivis_razion_ (2,68) %), Ruminococcus (2.21%), Lachnospiracea_incertae_sedis (2,12%) и Lachnobacterium (2,08%).

РИСУНОК 3. Состав преобладающего бактериального типа среди обработок in vitro . КОН, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и лузгой сои. Показаны 5 наиболее распространенных типов бактерий, а остальные не показаны ( n = 9).

Показатели альфа-разнообразия бактериального сообщества также представлены в таблице 3.Как и в случае с сообществом архей, никаких существенных различий по каким-либо индексам альфа-разнообразия не наблюдалось. Таким образом, замена кормовой клетчатки на NFFS в рационах не изменила богатства и разнообразия бактериального сообщества. Анализ PCoA, основанный на взвешенных показателях UniFrac, был проведен для сравнения двух методов лечения (рис. 4). Анализ ANOSIM не выявил значимых различий в структуре бактериального сообщества между обработками ( R = -0,100, P = 0.953). На главную координату 1, 2 и 3 приходилось 48,1, 14,6 и 13,6% общей вариации соответственно.

РИСУНОК 4. Анализ основных координат (PCoA) структур бактериального сообщества среди обработок in vitro . Графики PCoA были построены с использованием взвешенного метода UniFrac. КОН, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и шелухой сои ( n = 9).

Относительное количество метаногенных и бактериальных сообществ

Архей

На уровне филума Euryarchaeota , как наиболее преобладающий тип архей, составляет в среднем 99,9% всех последовательностей. Methanomassiliicoccus , Methanobrevibacter , Methanomicrobium , Methanobacterium и Methanosphaera из Euryarchaeota были пятью преобладающими родами в настоящем исследовании.Относительная численность Methanomassiliicoccus была значительно увеличена в группе TRT по сравнению с группой CON ( P = 0,001). Однако относительная численность Methanobrevibacter имела тенденцию к снижению в группе TRT ( P = 0,076). Точно так же относительное содержание Methanomicrobium было ниже в группе TRT, но не значительно ( P = 0,123) (рис. 5).

РИСУНОК 5. Разница в относительной численности 5 преобладающих родов архей (численность родов выражена в%).График с расширенной полосой погрешностей был выполнен с помощью программного обеспечения для биоинформатики (STAMP). Был использован двусторонний тест Уэлча, а инвертированный Уэлч составил 0,95. КОН, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и шелухой сои ( n = 9).

Бактерии

На уровне филума замена кормовой клетчатки на NFFS в рационах значительно снизила относительную численность Firmicutes ( P = 0.012) и имеет тенденцию к увеличению относительной численности Bacteroidetes ( P = 0,065). Другой тип, на который приходилось ≥1% от общих последовательностей по крайней мере в одном из образцов, не подвергался значительному влиянию обработок (рис. 6).

РИСУНОК 6. Разница в относительной численности 5 преобладающих типов бактерий (численность данного типа выражена в%). График с расширенной полосой погрешностей был выполнен с помощью программного обеспечения для биоинформатики (STAMP). Использовался двусторонний тест Уэлча с двусторонним тестом, а инвертированный Уэлч был равен 0.95. CON, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и шелухой сои ( n = 9).

На уровне рода, относительная численность, которая была представлена ​​≥0,1% от общего числа последовательностей по крайней мере в одном из образцов, была дополнительно проанализирована. Роды, подвергшиеся влиянию обработок, и шесть других преобладающих родов перечислены на рисунке 7. Все затронутые роды принадлежали к Firmicutes .По сравнению с группой CON, относительная численность наиболее подверженных влиянию родов снизилась. В частности, замена кормовой клетчатки на NFFS в рационах значительно снизила относительную численность Ruminococcus ( P = 0,031) и Clostridium XIVa ( P = 0,049) и имела тенденцию к уменьшению относительной численности Lachnospiracea_sed_iscerta P = 0,050), Coprococcus ( P = 0,053), Lachnobacterium ( P = 0.056) и Acetatifactor ( P = 0,097). Напротив, относительная численность Marvinbryantia ( P = 0,08) была значительно увеличена в группе TRT. Относительная численность Hydrogenoanaerobacterium ( P = 0,063) и Christensenella ( P = 0,063) имела тенденцию к увеличению в группе TRT. Кроме того, относительная численность Succiniclasticum , Sporobacter и Prevotella была выше, но относительная численность Acetobacteroides и Subdivision5_genera_incertae_sedis была ниже в группе TRT.Лечение не оказало на них значительного влияния.

РИСУНОК 7. Разница в относительной численности родов бактерий, составляющая ≥0,1% от общих последовательностей по крайней мере в одном из образцов и других преобладающих родов (численность родов выражена в%). График с расширенной полосой погрешностей был выполнен с помощью программного обеспечения для биоинформатики (STAMP). Был использован двусторонний тест Уэлча, а инвертированный Уэлч составил 0,95. КОН, контрольный рацион, основной общий смешанный рацион; TRT, лечебная диета, модифицированный общий смешанный рацион с заменой фуражной клетчатки пшеничными отрубями и шелухой сои ( n = 9).

Обсуждение

Нефуражные источники клетчатки производятся в нескольких отраслях промышленности, которые богаты клетчаткой (например, корма), но быстро выводятся из рубца (например, концентраты). Разумное использование NFFS может улучшить продуктивность и здоровье крупного рогатого скота на всех этапах лактации, потенциально контролируя затраты на корм (Bradford and Mullins, 2012). Большая часть непищевых волокон относительно переваривается по сравнению с кузнечными волокнами, что приводит к более высокой усвояемости (Bhatti and Firkins, 1995; Dann et al., 2007). В нашем исследовании замена кормовой клетчатки на NFSS значительно увеличила DMD, NDFD и ADFD, но численно увеличила концентрацию TVFA. Напротив, общая добыча газа численно снизилась, в отличие от концентрации TVFA. Это может быть объяснено тем фактом, что нефуражная клетчатка более усваивается, но не лучше при ферментации, чем клетчатка люцерны, которая обычно считалась лучшей кормовой клетчаткой. Производство CH 4 уменьшилось на 14,06%, а производство H 2 увеличилось в численном отношении на 8.45% с последующим значительным увеличением концентрации пропионата. Образование ацетата и бутирата приводит к образованию H 2 , который может быть использован для образования CH 4 метаногенными археями (Moss et al., 2000). При образовании пропионата пируват восстанавливается до пропионата, тогда как при образовании H 2 протоны (H + ) восстанавливаются до H 2 . Оба эти пути являются акцептирующими для электронов, поэтому Янссен (2010) полагал, что образование пропионата было альтернативным путем к образованию H 2 и сопровождалось снижением продукции CH 4 .Баланс между образованием пропионата и ацетата и бутирата играет ключевую роль в определении H 2 , доступного в рубце для использования метаногенными археями. Эти результаты показали, что замена кормовой клетчатки NFFS может снизить использование водорода в метаногенезе и сместить поток водорода с CH 4 на пропионат и H 2 за счет изменения относительной численности определенных архей или бактерий. Подобно предыдущим исследованиям, ингибирование продукции CH 4 в периодических культурах привело к перенаправлению метаболического водорода в сторону пропионата и H 2 (Ungerfeld, 2015).Mitsumori et al. (2012) обнаружили, что часть [H], выделенная из продукции CH 4 , перенаправляется на пропионат, а часть — в нетипичные поглотители [H], такие как H 2 .

Поскольку они являются единственными продуцентами метана в рубце, можно ожидать корреляции между количеством метаногенов и метаногенезом. Wallace et al. (2014) и Венеман и др. (2015) предположили, что количество архей, а не структура популяции, может быть основным фактором производства метана в рубце.Некоторые стратегии, в том числе добавление эфирных масел (Duarte et al., 2017b) или ионофоров (Shen et al., 2017), сокращают кишечные выбросы метана, подавляя активность или богатство микробиоты. Подавление микробиоты обычно приводит к ухудшению переваривания корма (Ungerfeld, 2015). Однако Morgavi et al. (2010) сообщили, что снижение выработки метана не повлияло на перевариваемость клетчатки в нескольких экспериментах in vitro . Шен и др. (2017) обнаружили, что добавление низина в рационы снижает выработку метана, в то время как переваривание корма не нарушается.Это можно объяснить изменениями микробной популяции. Различные группы метаногенов имеют разный метаногенный потенциал (Leahy et al., 2013), и сдвиг в сообществе метаногенов в сторону менее эффективного метаногенеза также может объяснить различия в производстве метана. Мы наблюдали снижение выработки метана и повышение концентрации пропионата, в то время как исчезновение сухого вещества увеличилось в настоящем исследовании. Возможно, что изменения в популяционной структуре микробиоты также могут повлиять на производство метана, например, на подавление численности или активности микробов.Belanche et al. (2016) обнаружили, что сапонины плодов плюща снижают производство метана, изменяя структуру сообщества метаногена и уменьшая его разнообразие. Напротив, хитозан способствовал сдвигу в структуре ферментации в сторону производства пропионата, чтобы уменьшить производство метана, что достигается за счет упрощения структуры в бактериальном сообществе. Следовательно, как богатство метаногена, так и популяционная структура микробного сообщества играют важную роль в метаногенезе.С другой стороны, лечение не повлияло на богатство и разнообразие сообщества архей и бактерий, наряду с аналогичным значением pH и производством TVFA, что также позволяет предположить, что замена кормовой клетчатки на NFFS в рационах не имела значительных пагубных последствий. эффекты на общую ферментацию рубца in vitro .

Археи

Метан вырабатывается в рубце как продукт нормальной ферментации кормов, и метаногены, которые принадлежат домену Archaea и типу Euryarchaeota , являются единственными известными микроорганизмами, способными продуцировать метан (Hook et al., 2010). Однако, по сравнению с количеством метаногенов, эффективность различных метаногенов считается более важной в метаногенезе (Shi et al., 2014). Учитывая положительную взаимосвязь увеличения продукции метана и увеличения количества транскриптов гена mcrA , считается, что метаногены, которые могут экспрессировать больше генов mcrA , вносят больший вклад в производство метана (Freitag and Prosser, 2009). В нашем исследовании различия между обработками наблюдались на уровне рода, где относительная численность Methanomassiliicoccus (принадлежит к семейству Methanomassiliicoccaceae ) была значительно увеличена, но относительная численность Methanobrevibacter имела тенденцию к снижению в группе TRT.Danielsson et al. (2017) сообщили, что несекретный Methanomassiliicoccaceae был в 1,5 раза более распространен среди эмиттеров с низким уровнем выбросов CH 4 , чем среди источников с высоким уровнем выбросов CH 4 . Луо и др. (2017) сообщили, что пищевые волокна гороха увеличили разнообразие структуры метаногенового сообщества толстой кишки свиней с переходом от Methanobrevibacter к Methanomassiliicoccus и Methanomassiliicoccus -подобному роду. Гидрогенотрофный путь, метилотрофный путь и ацетокластический путь — три основных пути метаногенеза. Methanobrevibacter — это один из видов гидрогенотрофного метаногена, который превращает H 2 и / или формиат в CH 4 (Leahy et al., 2013), а Methanomassiliicoccus , которые относятся к новому отряду Methanomassiliicoccales способность использовать субстраты метиламина для метаногенеза посредством H 2 -зависимого метилотрофного пути (Lang et al., 2015; Moissl-Eichinger et al., 2018). Хотя метаногенные археи могут приобретать субстраты из окружающей среды, некоторые виды могут повысить эффективность за счет установления контактов с простейшими, которые производят большие количества H 2 своими гидрогеносомами (Embley et al., 2003). Methanobrevibacter считается преобладающим метаногеном, ассоциированным с простейшими (Belanche et al., 2014), в то время как о связи между Methanomassiliicoccus и простейшими не сообщалось. По сравнению с Methanobrevibacter , Methanomassiliicoccus может быть менее эффективным в производстве метана. Различные источники клетчатки могут стимулировать рост различной микробиоты и изменять относительную численность микробного сообщества. Замена кормовых волокон на NFFS в рационах снизит выбросы CH 4 от жвачных животных за счет изменения относительной численности Methanobrevibacter и Methanomassiliicoccus на уровне архей.

Methanomassiliicoccus более распространен в нашем исследовании, чем Methanobrevibacter , который в предыдущем исследовании считался наиболее преобладающим родом (Janssen and Kirs, 2008). В другом недавнем исследовании (Danielsson et al., 2017) Methanobrevibacter также наблюдался как наиболее преобладающий род. Danielsson et al. (2017) использовали одни и те же праймеры как бактерий, так и архей для создания библиотек ампликонов 16S рРНК, что привело в среднем к 505 последовательностям архей на образец (61434 последовательности архей на образец в нашем исследовании).Различная глубина секвенирования может быть причиной разницы между нашим исследованием и другими. Как и в нашем исследовании, Paul et al. (2015) также сообщили о высокой численности Methanomassiliicoccaceae , присутствующих в рубце буйвола Нили-Рави, с помощью анализа 16S рДНК архей.

Бактерии

В настоящем исследовании в микробиоте рубца преобладали Bacteroidetes и Firmicutes , которые в большинстве исследований считаются преобладающими типами (Kim et al., 2010; де Менезес и др., 2011; Мартинес-Фернандес и др., 2016; Duarte et al., 2017a). Bacteroidetes считаются чистыми утилизаторами H 2 , тогда как тип Firmicutes включает продуцентов H 2 (Stewart et al., 1997). Belanche et al. (2016) сообщили, что добавление хитозана в контрольную диету способствовало сдвигу в модели ферментации в сторону производства пропионата, что объясняло примерно треть снижения метаногенеза, которое было достигнуто за счет замены фибролитических ( Firmicutes и Fibrobacteres ) амилолитическими бактериями ( Bacteroidetes и Proteobacteria ).В другом исследовании изменение микробиоты с увеличением соотношения Bacteroidetes к Firmicutes сопровождалось 30% снижением метаногенеза и увеличением производства пропионата при использовании хлороформа в качестве ингибитора метана (Martinez-Fernandez et al. , 2016). Kittelmann et al. (2013) наблюдали положительную корреляцию между наличием метаногенов и фибролитических бактерий. В настоящем исследовании группа TRT имела более высокую численность Bacteroidetes (в основном амилолитические бактерии) и более низкую численность Firmicutes (в основном фибролитические бактерии) по сравнению с группой CON.Такое замещение фибролитических бактерий амилолитическими бактериями может привести к более высокой концентрации пропионата как продуктов ферментации в группе TRT.

На уровне родов все роды бактерий, относительная численность которых изменилась ( P <0,1), принадлежали к типу Firmicutes . Большинство этих родов имеют более высокую относительную численность в группе CON, за исключением Marvinbryantia , Hydrogenoanaerobacterium и Christensenella . Marvinbryantia принадлежит к семейству Lachnospiraceae , которое разлагает сложные полисахариды до короткоцепочечных жирных кислот, включая ацетат, бутират и пропионат (Biddle et al., 2013). Hydrogenoanaerobacterium относятся к семейству Ruminococcaceae , которое содержит большое количество здоровых кишечных бактерий, продуцирующих бутират (Morissette et al., 2017). Недавнее исследование предполагает, что присутствие в кишечнике Christensenella , малочисленного (менее 0,001%) и высоконаследственного (передаваемого от родителей к потомству) рода бактерий, снижает прибавку массы тела у мышей с ожирением (Goodrich et al., 2014). Есть несколько упоминаний об этих родах, и неизвестно, участвуют ли они в метаболизме пропионата.Однако, как описано выше, все эти роды участвуют в энергетическом метаболизме и, возможно, имеют определенные отношения со смещением потока водорода в сторону пропионата.

Заключение

Теоретические предсказания смещения метаболизма H 2 от метаногенеза к производству пропионата были подтверждены диетическим вмешательством in vitro . Стратегия модифицированной диетической рецептуры может влиять на метаногенез, сдвигая поток водорода в сторону пропионата и частично в сторону H 2 .Сдвиг был достигнут заменой Firmicutes на Bacteroidetes и другой заменой Methanobrevibacter на Methanomassiliicoccus . В заключение, замена кормовой клетчатки на NFFS в рационах может быть значимой стратегией для сдвига потока водорода в сторону пропионата, и необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы выяснить, будет ли наблюдаться такая же модуляция микробиоты in vivo .

Авторские взносы

KW, BX и LJ разработали исследование.KW, XN, SZ и KC проводили эксперименты. KW, XN и LY проанализировали данные. KW написал рукопись. JT, XN, GZ, LJ и BX отредактировали документ. Все авторы внимательно прочитали и согласились нести ответственность за все аспекты работы.

Финансирование

Это исследование финансировалось Национальным планом ключевых исследований и разработок (гранты №№ 2016YFD0700205, 2016YFD0700201 и 2016YFD0500507).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сноски

  1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/

Список литературы

Аламоути, А. А., Алихани, М., Горбани, Г., и Зебели, К. (2009). Влияние включения нейтральных моющих растворимых источников клетчатки в рационы, различающиеся размером частиц корма, на потребление корма, пищеварительные процессы и продуктивность коров голштинской породы в середине лактации. Аним. Feed Sci. Technol. 154, 9–23. DOI: 10.1016 / j.anifeedsci.2009.07.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аллен, Д.М. и Грант Р. (2000). Взаимодействие кормов и влажных кормов из кукурузной глютена как источников клетчатки в рационах кормящих молочных коров 1. J. Dairy Sci. 83, 322–331. DOI: 10.3168 / jds.S0022-0302 (00) 74882-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беланче А., де ла Фуэнте Г. и Ньюболд К. Дж. (2014). Изучение сообществ метаногена, связанных с различными популяциями простейших в рубце. FEMS Microbiol. Ecol. 90, 663–677. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12423

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беланче А., Пинлоче Э., Прескетт Д. и Ньюболд К. Дж. (2016). Эффекты и механизм действия хитозана и сапонинов плодов плюща на микробиом, ферментацию и метаногенез в методе моделирования рубца. FEMS Microbiol. Ecol. 92: fiv160. DOI: 10.1093 / фемсек / fiv160

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Биддл, А., Стюарт, Л., Бланшар, Дж., И Лешин, С. (2013). Раскрытие генетической основы фибролитической специализации Lachnospiraceae и Ruminococcaceae в различных кишечных сообществах. Разнообразие 5, 627–640. DOI: 10.3390 / d5030627

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брэдфорд, Б. Дж., И Маллинз, К. Р. (2012). Приглашенный обзор: стратегии повышения продуктивности и здоровья молочного скота путем кормления нефуражными источниками клетчатки. J. Dairy Sci. 95, 4735–4746. DOI: 10.3168 / jds.2012-5393

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Капорасо, Дж. Г., Лаубер, К. Л., Уолтерс, В. А., Берг-Лайонс, Д., Лозупоне, К. А., Тернбо, П. Дж. И др. (2011). Глобальные паттерны разнообразия 16S рРНК на глубине миллионов последовательностей на образец. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108 (Приложение 1), 4516–4522. DOI: 10.1073 / pnas.1000080107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Даниэльссон, Р., Диксвед, Дж., Сан, Л., Гонда, Х., Мюллер, Б., Шнурер, А. и др. (2017). Производство метана у дойных коров коррелирует со структурой метаногенного и бактериального сообщества рубца. Фронт. Microbiol. 8: 226. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.00226

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Данн, Х., Картер, М., Котанч, К., Баллард, К., Такано, Т., и Грант, Р. (2007). Влияние частичной замены нейтральной моющей клетчатки в кормах на нейтральную моющую клетчатку в качестве побочного продукта в рационах крупного плана на послеродовые показатели молочных коров. J. Dairy Sci. 90, 1789–1801. DOI: 10.3168 / jds.2006-692

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

де Менезес, А. Б., Льюис, Э., О’Донован, М., О’Нил, Б. Ф., Клипсон, Н., Дойл, Э. М. (2011). Анализ микробиома молочных коров, получающих пастбищные рационы или рационы общего смешанного рациона. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 256–265. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2011.01151.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дуарте, А.К., Холман, Д. Б., Александер, Т. В., Дурмик, З., Верко, П. Э. и Чавес, А. В. (2017a). Тип подготовки кормового субстрата, включенный в качестве субстрата в систему RUSITEC, влияет на микробиоту рубца и характеристики ферментации. Фронт. Microbiol. 8: 704. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.00704

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дуарте, А. К., Холман, Д. Б., Александер, Т. В., Кири, К., Бревес, Г., и Чавес, А. В. (2017b). Температура инкубации, но не добавка пекового масла, влияет на выработку метана и микробиоту рубца в системе имитации рубца (Rusitec). Фронт. Microbiol. 8: 1076. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.01076

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдгар Р. К., Хаас Б. Дж., Клементе Дж. К., Айва К. и Найт Р. (2011). UCHIME улучшает чувствительность и скорость обнаружения химер. Биоинформатика 27, 2194–2200. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btr381

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эмбли, Т. М., ван дер Гизен, М., Хорнер, Д.С., Дьял П. Л., Белл С. и Фостер П. Г. (2003). Гидрогеносомы, митохондрии и ранняя эволюция эукариот. IUBMB Life 55, 387–395. DOI: 10.1080/152165403100015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эртль П., Зебели К., Цоллич В. и Кнаус В. (2015). Кормление побочными продуктами полностью заменило зерновые и зернобобовые у молочных коров и повысило коэффициент конверсии съедобных кормов. J. Dairy Sci. 98, 1225–1233. DOI: 10.3168 / jds.2014-8810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Freitag, T. E., and Prosser, J. I. (2009). Корреляция продукции метана и транскрипционной активности функциональных генов в торфяной почве. Заявл. Environ. Microbiol. 75, 6679–6687. DOI: 10.1128 / AEM.01021-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гантнер С., Андерссон А. Ф., Алонсо-Саез Л. и Бертилссон С. (2011). Новые праймеры для анализа сообщества архей на основе 16S рРНК в образцах окружающей среды. J. Microbiol. Методы 84, 12–18. DOI: 10.1016 / j.mimet.2010.10.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гудрич, Дж. К., Уотерс, Дж. Л., Пул, А. К., Саттер, Дж. Л., Корен, О., Блехман, Р. и др. (2014). Человеческая генетика формирует микробиом кишечника. Ячейка 159, 789–799. DOI: 10.1016 / j.cell.2014.09.053

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хухтанен П. (1993). Влияние источника энергии и содержания белка в концентрате на молочную продуктивность коров, получавших силос из травы ad libitum. Травяной корм Sci. 48, 347–355. DOI: 10.1111 / j.1365-2494.1993.tb01868.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хухтанен П., Яаккола С. и Саарисало Э. (1995). Влияние концентрированного источника энергии на молочную продуктивность дойных коров, получающих диету на основе травяного силоса. Аним. Sci. 60, 31–40. DOI: 10.1017 / S1357729800008109

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янссен, П. Х. (2010). Влияние водорода на образование метана в рубце и ферментацию уравновешивается кинетикой роста микробов и термодинамикой ферментации. Аним. Feed Sci. Technol. 160, 1–22. DOI: 10.1016 / j.anifeedsci.2010.07.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонсон, К. А., и Джонсон, Д. Э. (1995). Выбросы метана от крупного рогатого скота. J. Anim. Sci. 73, 2483–2492. DOI: 10.2527 / 1995.7382483x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кессель, Дж. А. С., и Рассел, Дж. Б. (1996). Влияние pH на метаногенез в рубце. FEMS Microbiol. Ecol. 20, 205–210.DOI: 10.1111 / j.1574-6941.1996.tb00319.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, М., Моррисон, М., Ю З. (2010). Состояние переписи филогенетического разнообразия микробиомов рубца. FEMS Microbiol. Ecol. 76, 49–63. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2010.01029.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Киттельманн, С., Зеедорф, Х., Уолтерс, В.А., Клементе, Дж. К., Найт, Р., Гордон, Дж. И. и др. (2013). Одновременное секвенирование ампликонов для изучения моделей совместного присутствия бактериальных, архейных и эукариотических микроорганизмов в микробных сообществах рубца. PLoS One 8: e47879. DOI: 10.1371 / journal.pone.0047879

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лана, Р. П., Рассел, Дж. Б., и Ван Амбург, М. Э. (1998). Роль pH в регулировании производства метана и аммиака в рубце. J. Anim. Sci. 76, 2190–2196. DOI: 10.2527 / 1998.7682190x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланг, К., Шульдес, Дж., Клингл, А., Похлейн, А., Даниэль, Р., и Брунеа, А.(2015). Новый режим энергетического метаболизма метаногенов седьмого порядка, выявленный сравнительным анализом генома « Candidatus methanoplasma termitum». Заявл. Environ. Microbiol. 81, 1338–1352. DOI: 10.1128 / aem.03389-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лихи, С. К., Келли, В. Дж., Ронимус, Р. С., Ведлок, Н., Альтерманн, Э., Эттвуд, Г. Т. (2013). Секвенирование генома бактерий рубца и архей и его применение в стратегиях снижения выбросов метана. Животное 7 (Дополнение 2), 235–243. DOI: 10.1017 / S1751731113000700

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лозупоне, К. А., Хамади, М., Келли, С. Т., и Найт, Р. (2007). Количественные и качественные измерения β-разнообразия позволяют по-разному взглянуть на факторы, структурирующие микробные сообщества. Заявл. Environ. Microbiol. 73, 1576–1585. DOI: 10.1128 / AEM.01996-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Луо, Ю., Chen, H., Yu, B., He, J., Zheng, P., Mao, X., et al. (2017). Пищевые волокна гороха увеличивают разнообразие метаногенов толстой кишки свиней с переходом от Methanobrevibacter к Methanomassiliicoccus-подобному роду и изменением количества трех гидрогенотрофов. BMC Microbiol. 17:17. DOI: 10.1186 / s12866-016-0919-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Магоч, Т., и Зальцберг, С. Л. (2011). FLASH: быстрая корректировка длины коротких чтений для улучшения сборки генома. Биоинформатика 27, 2957–2963. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btr507

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартинес-Фернандес, Г., Денман, С. Э., Янг, К., Чунг, Дж., Мицумори, М., и МакСвини, К. С. (2016). Ингибирование метана изменяет микробное сообщество, поток водорода и реакцию ферментации в рубце крупного рогатого скота. Фронт. Microbiol. 7: 1122. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.01122

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менке, К.Х. (1988). Оценка энергетической ценности корма, полученная на основе химического анализа и производства газа in vitro с использованием жидкости рубца. Аним. Res. Dev. 28, 7–55.

Google Scholar

Мицумори М., Синкай Т., Такенака А., Эниши О., Хигучи К., Кобаяси Ю. и др. (2012). Реакция пищеварения, ферментации рубца и микробных популяций на ингибирование образования метана галогенированным аналогом метана. Br. J. Nutr. 108, 482–491. DOI: 10.1017 / S0007114511005794

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Moissl-Eichinger, C., Паусан, М., Таффнер, Дж., Берг, Г., Банг, К., и Шмитц, Р. А. (2018). Археи — это интерактивные компоненты сложных микробиомов. Trends Microbiol. 26, 70–85. DOI: 10.1016 / j.tim.2017.07.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мориссетт Б., Талбот Г., Болье К. и Лессард М. (2017). Показатели роста поросят в течение первых двух недель лактации влияют на развитие кишечной микробиоты. J. Anim. Physiol.Anim. Nutr. 102, 525–532. DOI: 10.1111 / jpn.12784

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мосс, А. Р., Жуани, Дж. П., и Ньюболд, Дж. (2000). Производство метана жвачными животными: его вклад в глобальное потепление. Annales De Zootechnie 49, 231–253. DOI: 10,1051 / анимрес: 2000119

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нагараджа, Т., и Титгемейер, Э. (2007). Рубцовый ацидоз мясного скота: современные микробиологические и диетологические перспективы1, 2. J. Dairy Sci. 90, E17 – E38.

Google Scholar

Национальный исследовательский совет [NRC] (2001). Потребности молочного скота в питательных веществах. 7-е изд. Вашингтон, округ Колумбия: Национальная академия прессы.

Google Scholar

Паркс, Д. Х., Тайсон, Г. В., Гугенгольц, П., и Бейко, Р. Г. (2014). ШТАМП: статистический анализ таксономических и функциональных профилей. Биоинформатика 30, 3123–3124. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btu494

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Патра, А.К., Ю. З. (2012). Влияние эфирных масел на производство и ферментацию метана, а также на изобилие и разнообразие микробных популяций рубца. Заявл. Environ. Microbiol. 78, 4271–4280. DOI: 10.1128 / AEM.00309-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пол С. С., Деб С. М., Дей А., Сомванши С. П., Сингх Д., Ратхор Р. и др. (2015). Анализ 16S рДНК архей указывает на преобладание Methanobacterium и высокую численность Methanomassiliicoccaceae в рубце буйвола Нили-Рави. Anaerobe 35 (Pt B), 3–10. DOI: 10.1016 / j.anaerobe.2015.06.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перейра, М. Н., и Арментано, Л. Е. (2000). Частичная замена фуража источниками нефуражных волокон в рационах кормящих коров. II. Пищеварение и функция рубца. J. Dairy Sci. 83, 2876–2887. DOI: 10.3168 / jds.S0022-0302 (00) 75188-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перейра, М. Н., Гаррет Э. Ф., Эцель Г. Р. и Арментано Л. Э. (1999). Частичная замена фуража источниками нефуражных волокон в рационах кормящих коров. I. Работоспособность и здоровье. J. Dairy Sci. 82, 2716–2730. DOI: 10.3168 / jds.S0022-0302 (99) 75528-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рассел Дж. (1998). Важность pH в регулировании соотношения ацетата и пропионата в рубце и выработке метана in vitro. J. Dairy Sci. 81, 3222–3230.DOI: 10.3168 / jds.S0022-0302 (98) 75886-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сато, С. (2015). Подострый ацидоз рубца (SARA), состояние рубца и клеточный иммунитет у крупного рогатого скота. Japn. J. Vet. Res. 63 (Дополнение 1), S25 – S36.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Шэнь, Дж., Лю, З., Ю, З., и Чжу, В. (2017). Моненсин и низин по-разному влияют на ферментацию рубца и микробиоту in vitro. Фронт. Microbiol. 8: 1111. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.01111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ши, В., Мун, К. Д., Лихи, С. К., Канг, Д., Фрула, Дж., Киттельманн, С., и др. (2014). Фенотипы выхода метана связаны с дифференциальной экспрессией генов в микробиоме рубца овец. Genome Res. 24, 1517–1525. DOI: 10.1101 / gr.168245.113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стюарт К., Флинт Х. и Брайант М.(1997). «Бактерии рубца», в «Микробная экосистема рубца» , ред. П. Н. Хобсон и С. С. Стюарт (Лондон: Chapman and Hall), 10–72. DOI: 10.1007 / 978-94-009-1453-7_2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сток Р., Льюис Дж., Клопфенштейн Т. Дж. И Милтон К. (2000). Обзор новой информации об использовании побочных продуктов кормов мокрого и сухого помола в рационах откормочных площадок. J. Anim. Sci. 77 (E – Suppl.), 1–12. DOI: 10.2527 / jas2000.77E-Suppl1w

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Такай, К., и Хорикоши, К. (2000). Быстрое обнаружение и количественная оценка членов сообщества архей с помощью количественной ПЦР с использованием флуорогенных зондов. Заявл. Environ. Microbiol. 66, 5066–5072. DOI: 10.1128 / AEM.66.11.5066-5072.2000

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Унгерфельд, Э. М. (2015). Сдвиги в метаболических стоках водорода при ингибированной метаногенезом ферментации рубца: метаанализ. Фронт. Microbiol. 6:37. DOI: 10.3389 / fmicb.2015.00037

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Сост, П. Дж., Робертсон, Дж. Б., и Льюис, Б. А. (1991). Способы получения пищевых волокон, нейтральных детергентных волокон и некрахмальных полисахаридов в отношении питания животных. J. Dairy Sci. 74, 3583–3597. DOI: 10.3168 / jds.S0022-0302 (91) 78551-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Венеман, Дж. Б., Мютцель, С., Харт, К. Дж., Фолкнер, К. Л., Мурби, Дж. М., Пердок, Х.B., et al. (2015). Влияет ли диетическое снижение выработки метана в кишечнике на функцию рубца и продуктивность дойных коров? PLoS One 10: e0140282. DOI: 10.1371 / journal.pone.0140282

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уоллес, Р. Дж., Рук, Дж. А., Дати, К. А., Хислоп, Дж. Дж., Росс, Д. У., Маккейн, Н. и др. (2014). Обилие архей в пищеварительном тракте рубца может помочь прогнозировать выбросы метана от мясного скота. Sci.Реп. 4: 5892. DOI: 10.1038 / srep05892

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, J., Liu, M., Wu, Y., Wang, L., Liu, J., Jiang, L., et al. (2016). Лекарственные травы как потенциальная стратегия снижения производства метана микробиотой рубца: систематическая оценка с акцентом на экстракт семян Perilla frutescens . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 100, 9757–9771. DOI: 10.1007 / s00253-016-7830-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Веймер, П.Дж., Стивенсон, Д. М., Мертенс, Д. Р., Томас, Э. Э. (2008). Влияние кормления и вывода монензина на популяции отдельных видов бактерий в рубце лактирующих молочных коров, получавших рационы с высоким содержанием крахмала. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 80, 135–145. DOI: 10.1007 / s00253-008-1528-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уильямс, Ю. Дж., Поповски, С., Ри, С. М., Скиллман, Л. К., Туви, А. Ф., Нортвуд, К. С. и др. (2009). Вакцина против метаногенов рубца может изменить состав популяций архей. Заявл. Environ. Microbiol. 75, 1860–1866. DOI: 10.1128 / AEM.02453-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Метаногенез из сточных вод, стимулированный добавлением элементарного марганца

Влияние элементарного марганца на метаногенез

Во время серийного эксперимента глюкоза использовалась в качестве источника органического углерода, который можно было быстро ферментировать до ЛЖК. Таким образом, было доказано, что процесс метаногенеза является определяющим этапом 20 .На рис. 1а показано накопление метана в свободном пространстве за все время работы в 120 часов. Скорость продукции метана в контроле была медленной до 48 часов из-за накопления ЛЖК, а именно пропионовой кислоты, которая могла ингибировать активность метаногенных архей 22 . Затем, после периода адаптации, дебит метана увеличился с 60 часов и был рассчитан как примерно 6,2 ± 0,1 мМ / гVSS / ч в течение всего периода эксплуатации. Чтобы исследовать влияние элементарного марганца на метаногенез, в анаэробные системы добавляли 2 г / л, 4 г / л и 8 г / л порошка марганца.При добавлении 2 г / л порошка марганца накопление метана до 48 часов немного увеличилось, а затем наблюдалось резкое повышение через 60 часов с конечным выходом метана 2,44 ± 0,15 M / gVSS и производительностью 21,5 ± 1,5 мМ / gVSS. / ч, что было примерно в 2,7 раза и в 3,5 раза выше, чем в контроле. Интересный результат был получен с добавлением порошка марганца 4 г / л и 8 г / л, что процесс получения метана происходил быстро без адаптации, по сравнению с двумя другими экспериментальными анализами.Кроме того, как выход метана, так и производительность были значительно увеличены с конечным выходом метана 2,99 ± 0,37 и 2,64 ± 0,26 М / г ПСС и производительностью 27,2 ± 2,2 и 21,5 ± 0,3 мМ / г ПСС / ч, соответственно. Однако увеличение дозировки элементарного марганца до 8 г / л не привело к максимальному выходу метана и скорости его производства, что указывает на то, что 4 г / л может быть более подходящей концентрацией добавления для метаногенеза в настоящем исследовании.

Рисунок 1

CH 4

Производство

( a ) и CO 2 ( b ) во время анаэробного сбраживания с различными дозами добавления элементарного марганца.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех тестов.

Концентрации CO 2 также были обнаружены в течение всего исследования, и результаты показаны на рис. 1b. Концентрации CO 2 достигли пика через 12 часов, а затем начали снижаться, в основном из-за начала процесса метаногенеза. Как и предполагалось, очевидная разница в концентрациях CO 2 наблюдалась при добавлении элементарного марганца. Нормы расхода CO 2 с добавками элементарного марганца были намного выше, чем у контроля.Более того, через 46 часов практически не было определено накопление CO 2 при добавлении элементарного марганца 4 г / л и 8 г / л, а при добавлении элементарного марганца 2 г / л накопление наблюдалось гораздо ниже, чем в контроле, что показал рост осадка между 36 и 60 часами, а затем оставался на постоянном уровне. Разница в количестве CO 2 между контрольным анализом и анализом элементарного марганца с концентрацией 4 г / л составляла около 0,93 M / gVSS. Следовательно, было разумно считать, что дополнительный CH 4 , образовавшийся с добавлением марганца, был преобразован из CO 2 .

Электроны, обычно обеспечиваемые водородом, были необходимы для преобразования CO 2 в CH 4 с водородом в качестве субстрата 23 . Литература показала, что несколько видов элементарных металлов могут служить исходными донорами электронов для образования CH 4 из CO 2 посредством катодной деполяризации 15,16 . В настоящем исследовании были определены ионы марганца в жидкой фазе, чтобы указать, может ли дополнительный марганец высвобождать электроны в качестве доноров для метаногенеза, и результаты показаны на рис.2. Концентрация ионов марганца с добавлением 2 г / л марганца медленно увеличивалась до 100 ч, а затем стабилизировалась около 100 мг / л. Однако по мере увеличения концентрации марганца до 4 и 8 г / л скорость образования ионов марганца быстро увеличивалась и достигла пика около 75 мг / л через 36 и 22 часа соответственно. Затем концентрация ионов марганца стала уменьшаться. В частности, она снизилась до нуля при добавлении 4 г / л марганца через 96 часов.

Рисунок 2

Концентрация ионов марганца во время исследовательской операции.

Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех тестов.

Эти результаты показали, что дополнительный марганец мог действовать как доноры электронов, что было аналогично другим металлам 15 . Поскольку система анаэробного ила состояла из смешанных бактерий, предполагалось, что в системе анаэробного сбраживания могут существовать некоторые виды гетеротрофных окисляющих марганец микроорганизмов, которые могут окислять ионы марганца до диоксида марганца, что приводит к снижению концентрации ионов марганца.Кроме того, другой возможностью может быть прямой перенос электронов, при котором метаногены действуют как окислитель марганца, забирая электроны непосредственно у марганца для восстановления CO 2 .

Более того, тщательное изучение производительности CH 4 и концентраций ионов марганца показало, что скорость образования CH 4 значительно увеличивалась в присутствии ионов марганца (рис. 1a и 2). В частности, при добавлении 4 г / л и 8 г / л элементарного марганца концентрация ионов марганца быстро увеличивалась до пика и поддерживалась около 40 мг / л в течение первых 60 часов.И за это время производительность Ch5 была особенно выше, чем в контроле, в то время как при добавлении 2 г / л элементарного марганца производительность CH 4 не увеличивалась резко до тех пор, пока количество ионов марганца в жидкой фазе не достигло примерно 50. мг / л через 48 ч. Впоследствии, темпы добычи СН 4 с 4 г / л и 8 г / л марганца незначительно снизилась с уменьшением ионов марганца, но с 2 г / л Марганец добавляют СН 4 скорость производства постоянно увеличивается за счет наличие высокодозированных ионов марганца.Эта разумная корреляция между производительностью CH 4 и ионами марганца подразумевает, что генерируемые ионы марганца должны быть надежной причиной усиления метаногенеза, что согласуется с предыдущим исследованием, опубликованным Nandan et al. 24 .

Анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) был проведен с использованием автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа Quanta 450 компании FEI для проверки возможных образовавшихся оксидов марганца на основе такой гипотезы.На рис. 3 показано СЭМ-наблюдение порошка марганца и образовавшихся оксидов марганца. Поверхность исходного добавленного марганца была плоской с острыми краями (рис. 3а), а после 120 ч анаэробной реакции поверхность оказалась шероховатой со слоем распределения оксидов марганца (рис. 3б, в). Также следует отметить, что образующиеся оксиды марганца обладали разнообразной структурой. На рис. 3d показаны разновидности шаровидных оксидов марганца со средним диаметром около 3 мкм, а на рис.3д изображен вид оксида марганца в форме стержня со средней длиной около 5 мкм. Оба эти вида оксидов марганца были обычными в процессе окисления марганца 25 . Интересно, что это исследование получило своего рода цветочно-подобные оксиды марганца (рис. 3f), которые были признаны новым типом биогенных оксидов марганца.

Рисунок 3

СЭМ-изображения ( a ) начальной мощности марганца, ( b , c ) конечной мощности марганца, ( d ) шарообразного стержня MnO x , ( e ) стержня -подобный MnO x , ( f ) подобный цветку MnO x .

Наблюдение за оксидами марганца указывало на существование процесса окисления марганца в анаэробной системе пищеварения. Для исследования функциональных штаммов во время окисления иона марганца был проведен анализ библиотеки клонов генов 16S рРНК посевного материала семян (бактерий). Результаты показали, что Firmicutes , вид хорошо известных марганецокисляющих бактерий 26,27 , присутствовал в образцах анаэробного ила (дополнительная информация), которые, как предполагалось, были функциональными штаммами, участвовавшими в окислении ионы марганца.

Эти результаты показали, что соответствующие дозировки добавления марганца могут не только улучшить процесс метаногенеза, но и избежать потенциального загрязнения, вызываемого ионами марганца. 28 . Более того, многие литературные источники продемонстрировали, что биогенные оксиды марганца являются высокореактивными минералами, которые обладают гораздо более высокой сорбционной и окислительной способностью по отношению к ионам металлов, чем абиотические 29 . Следовательно, усиление процесса метаногенеза добавлением элементарного марганца казалось эффективным и экономичным методом из-за извлечения как биотоплива, так и биогенных оксидов марганца с небольшим загрязнением.

Значение pH было важным фактором влияния на биологический метаногенез. Начальные значения pH анаэробной системы были доведены до 7,2 ± 0,1 с помощью 0,1 М HCl, а конечные значения pH составили 5,5 ± 0,1 (контроль), 7,4 ± 0,1 (2 г / л), 8,4 ± 0,1 (4 г / л). и 8,9 ± 0,1 (8 г / л), соответственно, что свидетельствует об очевидной тенденции к увеличению с повышением содержания элементарного марганца. Во время процесса метаногенеза значения pH могут увеличиваться из-за потребления протонов, которые использовались для образования H 2 , предшественника гидрогенотрофного метаногенеза 23,30 .Более высокие значения pH, полученные с добавлением элементарного марганца, были тесно связаны с выходами метана, что могло указывать на то, что производство H 2 в качестве промежуточного продукта и дальнейшего ускорения метаногенеза было разумным.

Производство метана микробиологическим катализом

Хотя избыток CH 4 был определен с потреблением CO 2 , не было установлено, было ли преобразование опосредовано микробиологическим процессом. По этим причинам были использованы два вида методов, чтобы проверить, катализируется ли процесс получения избытка CH 4 микроорганизмами.

Сначала анаэробный ил был удален из системы разложения, а другие условия были такими же, как в периодическом эксперименте с добавлением 4 г / л марганца. На рис. 4а показан состав газа в течение всей операции без добавления анаэробного ила. Было очевидно, что CH 4 не определялся в течение всего периода эксплуатации, хотя CO 2 снизился до 6,59 ± 0,31 М через 46 ч. Более того, в конце наблюдался гораздо более высокий уровень ионов марганца — 415,0 мг / л.Было разумно считать, что высокое давление CO 2 в газовой фазе приводит к увеличению содержания бикарбонат-иона в жидкой фазе, что ускоряет катодную деполяризацию элементарного марганца. Кроме того, образовавшиеся ионы марганца не могли быть дополнительно окислены в отсутствие окисляющих марганец микроорганизмов. Следовательно, концентрация ионов марганца в этом тесте была выше, чем в периодических экспериментах. Кроме того, из-за нехватки метаногенов в анаэробной системе израсходованный CO 2 нельзя было использовать для синтеза CH 4 , хотя электроны могли быть обеспечены элементарным марганцем.Эти результаты показали, что одновременное потребление CO 2 и марганца было опосредовано химической реакцией, и для участия в процессе производства CH 4 требовалось участие микроорганизмов.

Рисунок 4

Состав газа без добавки анаэробного ила

( a ) и с добавкой BES ( b ) и концентрация Mn 2+ с добавкой BES ( c ). Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех тестов.

Кроме того, поскольку среда для разложения была приготовлена ​​без стерилизации, органическое содержимое могло быть преобразовано в CO 2 в присутствии микроорганизмов, что могло вызвать увеличение содержания CO 2 через 46 часов. Высокая концентрация ионов марганца, полученная в этом тесте, также может означать существование окисляющих марганец микроорганизмов в анаэробном иле.

Во-вторых, один из видов ингибитора метаногенеза, 2-бромэтансульфонат (BES), был добавлен в среду с полной системой переваривания, содержащей ил.В систему вводили 4 г / л марганца, и испытание проводили в тех же условиях, что и упомянутые выше, за исключением добавления 20 мМ BES.

Производство как CH 4 , так и CO 2 с добавленным BES показано на рис. 4b. CO 2 быстро образовывался за 12 часов в результате процессов ацидогенеза и ацетогенеза. Тенденция внезапного снижения CO 2 была обнаружена с добавлением марганца, в то время как тенденция к медленному увеличению в отсутствие марганца.Хотя ионы марганца также определялись с добавлением BES (рис. 4c), не было продуцировано CH 4 из-за ингибирующего воздействия на микробиологический метаногенез, вызванного BES. Таким образом, результаты могут дополнительно указывать на то, что избыток CH 4 , образовавшийся в эксперименте с bacth, был опосредован микробиологическим катализом.

Метаногенез из CO

2 с марганцем в качестве доноров электронов

Как упоминалось выше, предполагалось, что избыток генерируемого метана в анаэробных системах будет преобразован из CO 2 с элементарным марганцем в качестве доноров электронов на основе одновременного CO 2 и потребления марганца и производства CH 4 и ионов марганца.Чтобы подтвердить это предположение, было проведено еще одно испытание с CO 2 в качестве единственного источника углерода в анаэробной смеси и с концентрацией марганца 4 г / л. На рисунке 5a показано производство CH 4 и потребление CO 2 в газовой фазе. Конечное накопление CH 4 достигло около 0,46 ± 0,01 M / gVSS, что было почти эквивалентно фактическим потерям CO 2 (фактические потери CO 2 составили около 0,48 ± 0,02 M / gVSS, а избыточное потребление СО 2 на рис.5а был вызван многократным отбором газовых компонентов из верхнего пространства). Как и ожидалось, также были обнаружены ионы марганца (рис. 5b), и не было обнаружено тенденции к снижению концентрации ионов марганца, что согласуется с предыдущим обсуждением, из-за нехватки источников органического углерода для гетеротрофных окисляющих марганец микроорганизмов. Следовательно, было доказано, что потеря CO 2 в периодических экспериментах с добавлением марганца была использована метаногенами для создания CH 4 с электронами, поставляемыми элементарным марганцем посредством катодной деполяризации.Таким образом, весь процесс метаногенеза с добавлением марганца можно представить в виде следующей реакции:

Рисунок 5

CH 4 производство и CO 2 потребление

( a ) и концентрация Mn 2+ ( b ) с CO 2 в качестве единственного источника углерода. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех тестов.

Влияние элементарного марганца на образование ЛЖК

Концентрации ЛЖК определялись в течение всего периода эксплуатации, и только ацетат и пропионат были обнаружены в жидкой фазе.Производство и потребление этих двух типов ЛЖК показано на рис. 6. Простые органические вещества можно быстро ферментировать до летучих кислот в анаэробных условиях 18 , таким образом, и ацетат, и пропионат были произведены в течение 12 часов с глюкозой, служившей субстратом. . При добавлении марганца в настоящем исследовании наблюдались значительные различия в концентрациях ацетата (рис. 6а). Концентрации ацетата в контроле колебались между 450 мг / л и 600 мг / л, а потребление небольшого количества ацетата, одного из субстратов для метаногенов, соответствовало выработке CH 4 во время исследования (рис.1а). Однако при добавлении 2 г / л марганца концентрация ацетата упала до 0 мг / л через 84 часа. В результате, дебит CH 4 за этот период заметно увеличился (рис. 1а). Увеличение концентрации марганца до 4 г / л привело к снижению содержания ацетата через 12 ч, которое составило всего около 250 мг / л, что составляет всего 45,5% от контроля. Кроме того, аналогично предыдущему, концентрация ацетата снизилась до 0 мг / л через 84 часа. Концентрация ацетата при добавлении 8 г / л марганца сильно изменилась.Хотя снижение образования ацетата также было обнаружено через 12 часов, концентрация внезапно увеличилась через 60 часов после периода стационарной фазы, а затем медленно снизилась. Предполагалось, что в пищеварительной системе имели место некоторые ингибирующие эффекты на метаногенез.

Рисунок 6

Сравнение концентраций ( a ) уксусной кислоты и ( b ) пропионовой кислоты с различными дозами добавления элементарного марганца. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения трех тестов.

Как упоминалось выше, добавление 4 и 8 г / л элементарного марганца может стимулировать метаногенез из CO 2 . Дальнейший расчет выхода CH 4 и потребления CO 2 показал, что часть CH 4 продуцируется другим путем, а именно, уксусными метаногенами с использованием ацетата в качестве субстрата. Таким образом, активность как гидрогенотрофных метаногенов, так и уксусных метаногенов усиливалась добавлением марганца. Между тем, тщательное изучение и сравнение производства CH 4 и расхода ацетата показало, что через 84 часа выход CH 4 с добавлением 2 и 4 г / л марганца все еще демонстрирует тенденцию к увеличению (рис.1а), хотя ацетат расходуется полностью (рис. 6а). Более того, производительность CH 4 с добавлением 4 г / л марганца была ниже, чем производительность с добавлением 2 г / л марганца в течение этого периода, что могло быть вызвано ограничением CO 2 (рис. 1b). Однако производство CH 4 не показало более высокой тенденции к увеличению с 8 г / л марганца, хотя наблюдался высокий уровень ацетата. Согласно Fukuzaki et al. , что метаногенез из ацетата может хорошо протекать от pH 6 до pH 8 31 , таким образом, высокое значение pH (8.9 ± 0,1), вызванное добавлением марганца, было предположительно разумным объяснением накопления ацетата при высоких дозах марганца.

Тем не менее, влияние марганца на производство пропионата казалось относительно простым. Концентрации пропионата с 4 и 8 г / л марганца сильно отличались от таковых в контроле и с добавлением 2 г / л марганца, что составляло около 42,8% от последних двух. Результаты по концентрациям ЛЖК показали, что добавленный марганец также может усиливать ацетокластический метаногенез.

Производители метана в рубце и стратегии смягчения

Метаногены — единственные известные микроорганизмы, способные производить метан, что делает их интересными при изучении стратегий борьбы с выбросами метана. Был проведен ряд экспериментов для изучения популяции метаногена в рубце крупного рогатого скота и овец, а также взаимоотношений метаногенов с другими микроорганизмами. Виды метаногена в рубце различаются в зависимости от диеты и географического положения хозяина, как и метаногенез, который можно уменьшить, изменив состав рациона или добавив в рацион монензин, липиды, органические кислоты или растительные соединения.Другие стратегии снижения выбросов метана, которые были исследованы, — это отключение организма и вакцины. Эти методы смягчения воздействий прямо или косвенно нацелены на популяцию метаногена в рубце, что приводит к различной степени эффективности. В этой статье описываются метаногены, обнаруженные в рубцах крупного рогатого скота и овец, а также ряд эффективных стратегий снижения выбросов метана in vivo .

1. Введение

Производство метана посредством кишечной ферментации вызывает озабоченность во всем мире из-за его вклада в накопление парниковых газов в атмосфере, а также из-за того, что скармливаемая им энергия расходуется на животных.Метан вырабатывается в рубце и задней кишке животных группой из архей , известных под общим названием метаногены, которые принадлежат к типу Euryarcheota . Среди домашнего скота производство метана является самым большим у жвачных животных, поскольку метаногены могут свободно производить метан в ходе нормального процесса переваривания корма. Много исследований было направлено на разработку стратегий борьбы с выбросами метана, которые будут использоваться у жвачных животных, и они были рассмотрены в других источниках [1–7]. Стратегии борьбы с загрязнением часто ограничиваются кормом, условиями содержания, физиологическим состоянием и использованием животного, а также государственными постановлениями; что приводит к трудностям в применении универсального подхода к проблеме снижения уровня кишечного метана.С этой целью цель данной статьи — предоставить информацию о кишечной ферментации и метаногенах, а также о некоторых стратегиях снижения выбросов метана, которые показали эффективность in vivo .

2. Метан и жвачные животные

Парниковые газы, такие как углекислый газ, метан, закись азота и озон, способствуют изменению климата и глобальному потеплению за счет поглощения инфракрасного излучения в атмосфере [8]. Метан классифицируется как следовой газ, и его общая глобальная концентрация оценивается в 1774 ± 1.8 частей на миллиард (ppb), с общим увеличением на 11 ppb с 1998 года [9]. Метан является особенно мощным газом из-за его потенциала глобального потепления, в 25 раз превышающего углекислый газ, и его 12-летнего существования в атмосфере; это второй по величине антропогенный парниковый газ после углекислого газа [9, 10]. Кроме того, метан способен увеличивать содержание озона в тропосферной области атмосферы, где возникает парниковый эффект, и увеличивать водяной пар в стратосфере, что может увеличить радиационную силу газа примерно на 70% [8].В глобальном масштабе 50–60% выбросов метана приходится на сельскохозяйственный сектор, особенно в результате животноводства; основным источником метана являются жвачные животные [11, 12].

Домашние жвачные животные, такие как крупный рогатый скот, овцы и козы, производят до 86 миллионов метрических тонн (Тг) метана в год [13]. Примерно 18,9 тг от молочного скота, 55,9 тг от мясного скота и 9,5 тг от овец и коз [13]. По данным Johnson and Ward [14], глобальный годовой вклад метана буйволами составляет 6.2–8,1 Тг, 0,9–1,1 Тг у верблюдов, а производство метана в кишечнике свиней и лошадей составляет примерно 0,9–1,0 и 1,7 Тг, соответственно.

Метан образуется в рубце в результате нормального брожения кормов. Хотя производство метана также может происходить в нижних отделах желудочно-кишечного тракта, как и у нежвачных животных, 89% метана, выделяемого жвачими животными, вырабатывается в рубце и выдыхается через рот и нос [15]. Когда метан выбрасывается в атмосферу, жвачные животные теряют примерно 2–12% энергии, полученной из кормов, в зависимости от рациона [14].

Потери метана в атмосферу зависят от вида жвачных. Оценки связанных с рационом потерь энергии из метана для молочного, пастбищного и откормочного скота варьируются от 5,5–9,0%, 6,0–7,5% и 3,5–6,5% соответственно [14]. У буйволов и верблюдов потеря калорийности пищи в виде метана составляет 7,5–9,0% и 7,0–9,0% соответственно [14]. Оценки потерь метана от жвачных животных также различаются в зависимости от географического положения, качества корма, потребления корма, состава корма и обработки корма [14].Влияние пищевых компонентов на выбросы метана будет рассмотрено далее в Разделе 4.1.

3. Метаногены
3.1. Характеристики и экосистема

Метаногены принадлежат домену Archaea и филюму Euryarchaeota [16]. В отличие от бактерий , метаногены не имеют пептидогликана в клеточной стенке, замещенного псевдомуреином в Methanobrevibacter и Methanobacterium , гетерополисахаридом в Methanosarcina, и белком в Methanomicrobium.Все метаногены имеют кофермент F 420 , который является кофактором, необходимым для таких ферментов, как гидрогеназа и формиатдегидрогеназа, и получил свое название из-за его поглощения при 420 нм, что позволяет ему флуоресцировать сине-зеленым при 470 нм [17]. Другой характеристикой кофермента метаногенов является кофермент M, который либо продуцируется метаногенами, такими как Methanobacterium , либо требуется из внешнего источника, как в случае с Methanobrevibacter ruminantium [18].Коэнзим М, или 2-меркаптоэтансульфоновая кислота, метилируется с образованием метана [19].

Характеристики клеток также могут сильно различаться в зависимости от метаногена. Methanobrevibacter ruminantium имеет форму стержня с переменной подвижностью и может использовать водород, диоксид углерода и формиат в качестве субстратов для производства метана [16]. Methanobacterium formicicum , который находится в том же порядке ( Methanobacteriales ), что и Methanobrevibacter , может иметь форму стержня или нити без подвижности и может использовать те же субстраты, что и Methanobrevibacter [16]. Methanomicrobium mobile имеет форму стержня и является подвижным, использует как водород, так и диоксид углерода, а также формиат для производства метана [16]. Наконец, Methanosarcina barkeri и Methanosarcina mazeii имеют кокковидную форму, но не имеют подвижности [16]. Порядок Methanosarcinales содержит только метаногены с цитохромами и может расти на самом широком диапазоне субстратов [20]. Цитохромы представляют собой мембранные переносчики электронов, которые играют роль в окислении метильных групп до диоксида углерода [21]. Methanosarcina barkeri может производить метан из водорода и диоксида углерода, ацетата, метиламинов и метанола, тогда как Methanosarcina mazeii может использовать те же субстраты, за исключением водорода и диоксида углерода [16].

Метаногены с цитохромами имеют выход роста 7 г на моль метана по водороду и диоксиду углерода, а время удвоения превышает 10 часов [20]. Метаногены без цитохромов имеют выход роста 3 г на моль метана по водороду и диоксиду углерода, а минимальное время удвоения составляет 1 час [20].Более подробное обсуждение таксономии можно найти в Garcia et al. [22], а обзор метаногенов с акцентом на цитохромы можно найти у Thauer et al. [20].

Метаногены находятся не только в рубце крупного рогатого скота и других жвачных животных. В последнее время проявился интерес к наличию метаногенов в кишечнике человека, и с помощью пиросеквенирования 454 было обнаружено архей , которые чаще встречаются в толстом кишечнике людей с ожирением [23]. ПЦР в реальном времени была использована для обнаружения Methanobrevibacter smithii и Methanosphaera stadtmanae в фекалиях человека [24], а также метаногенов Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter thaueri , Methanobrevibacter thaueri были культивированы, Methanobrevibacter thaueri были культивированы, Methanobrevibacter thaueri были культивированы, Methanobrevibacter thaueri 963 фекалии лошади, коровы, гуся и овцы соответственно [25].Наконец, Methanobrevibacter oralis был выделен в поддесневых участках пациентов с пародонтозом [26].

3.2. Производство метана

Основные метаногены в рубце крупного рогатого скота используют водород и углекислый газ, но существует группа метаногенов рода Methanosarcina , которые медленно растут на водороде и диоксиде углерода и поэтому удерживают определенную нишу, используя метанол и метиламины для производят метан [27, 28]. Формиат, образующийся при производстве ацетата, также можно использовать в качестве субстрата для метаногенеза, хотя вместо этого он часто быстро превращается в водород и диоксид углерода [27, 29].Летучие жирные кислоты (ЛЖК) обычно не используются в качестве субстратов для метаногенеза, поскольку их превращение в диоксид углерода и водород — длительный процесс, который тормозится обновлением рубца [19]. Поэтому в метаногенезе часто используются водород и углекислый газ, образующиеся при ферментации углеводов, поскольку образуются ЛЖК [27]. Удаляя водород из окружающей среды рубца в качестве конечной стадии ферментации углеводов, метаногены позволяют микроорганизмам, участвующим в ферментации, функционировать оптимально и поддерживают полное окисление субстратов [30].Ферментация углеводов приводит к образованию водорода, и, если этот конечный продукт не удалить, он может ингибировать метаболизм микроорганизмов в рубце [30].

3.3. Важные штаммы

Популяция метаногена в рубце может отличаться в зависимости от исследуемого вида жвачных. Methanobrevibacter ruminantium и Methanomicrobium mobile были обнаружены как основные метаногены в рубце овцы Янагита и соавторами [31] с помощью флуоресцентной гибридизации in situ , нацеленной на 16S рРНК.Райт и его коллеги [32] идентифицировали клоны из жидкости рубца овцы, похожие на культивируемые метаногены из отряда Methanobacteriales . В другом исследовании метаногенов рубца овцы Wright et al. [33] идентифицировали клоны из жидкости рубца овцы, аналогичные метаногенам порядков Methanobacteriales и Methanomicrobiales , а также ранее не идентифицированные последовательности. Метаногены из рубца овец и крупного рогатого скота были исследованы в исследовании Nicholson et al.[34] с использованием гель-электрофореза в временном градиенте и обнаружил сходство с таковыми из порядков Methanobacteriales и Methanosarcinales , хотя также были обнаружены ранее некультивируемые метаногены. Райт и его коллеги [35] также завершили анализ разнообразия овец из Венесуэлы и пришли к выводу, что большинство идентифицированных клонов принадлежало к роду Methanobrevibacter , причем самая большая группа клонов была подобна Methanobrevibacter gottschalkii .

В рубце крупного рогатого скота Уитфорд и его коллеги [36] смогли обнаружить Methanobrevibacter ruminantium как самую большую группу метаногенов у лактирующего молочного скота, получавшего общий смешанный рацион, за которым следует Methanosphaera stadtmanae . Выделение метаногенов от пастбищного скота Джарвисом и соавт. [37] предположили, что Methanomicrobium mobile может присутствовать в количестве 10 6 клеток / мл. Methanobacterium formicicum был выделен как второй по распространенности метаноген, за ним следует изолят, фенотипически сходный с Methanosarcina barkeri [37]. Methanobrevibacter spp. не был обнаружен у пастбищного рогатого скота, хотя он был обнаружен у крупного рогатого скота, содержащегося в помещении и получавшего общий смешанный рацион [36]. Райт и его коллеги [38] идентифицировали метаногены из библиотеки клонов жидкости рубца от крупного рогатого скота в Онтарио, Канада, который кормился преимущественно кукурузой. Было обнаружено, что клоны имеют более чем 95% сходство последовательностей с Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter thaueri, Methanobrevibacter smithii, и Methanosphaera stadtmanae [38].В том же исследовании была создана библиотека клонов из жидкости рубца крупного рогатого скота с острова Принца Эдуарда, который питался побочными продуктами картофеля [38]. Было обнаружено, что клоны имеют более чем 95% сходство последовательностей с Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter ruminantium, и Methanobrevibacter thaueri [38]. Кроме того, в составе рубца крупного рогатого скота из Онтарио и с острова Принца Эдуарда были обнаружены клоны метаногена, уникальные для географического положения, из которого они произошли, что указывает на то, что диета, а также географическое положение хозяина могут играть роль в существующем разнообразии популяции метаногена. .

Наличие штамма метаногена также было исследовано, поскольку оно связано с эффективностью корма. Недавняя работа Чжоу и его коллег [39, 40] исследовала разнообразие метаногенов в рубце мясного скота с высокой или низкой эффективностью корма. В исследовании 2009 г. Methanosphaera stadtmanae и Methanobrevibacter sp. AbM4 были в большем количестве среди неэффективных животных, в то время как общий размер популяции метаногена в рубце существенно не отличался между животными с разной эффективностью корма [39].В исследовании 2010 года, когда у них также был крупный рогатый скот, получавший высококалорийный или низкокалорийный рацион, высококалорийный рацион был связан с присутствием Methanobrevibacter smithii SM9 и Methanobrevibacter sp. AbM4, в то время как преобладающим метаногеном в низкокалорийной диете был Methanobrevibacter ruminantium [40] . Methanobrevibacter smithii был обнаружен только у высокоэффективных животных.

Кроме того, место в рубце, из которого обнаруживаются метаногены, играет роль в обнаружении метаногенов.В исследовании Shin и его коллег [41] корейской корове кормили рисовой шелухой и концентратом, а образцы жидкости рубца, твердого вещества рубца и эпителия рубца были взяты. Преобладающий метаноген рубца в жидкости рубца и эпителии рубца принадлежит к семейству Methanomicrobiaceae [41]. Твердое тело рубца преимущественно состоит из метаногенов семейства Methanobacteriaceae , которое является семейством метаногенов, обычно обнаруживаемым в рубце крупного рогатого скота [41].

3.4. Связь с другими микроорганизмами

Известно, что метаногены имеют симбиотические отношения, включающие межвидовой перенос водорода с микроорганизмами рубца, особенно с простейшими организмами рубца, где метаногены могут быть связаны внутриклеточно и внеклеточно [30]. Обычные простейшие в рубце крупного рогатого скота, имеющие такую ​​взаимосвязь, относятся к родам Entodinium, Polyplastron , Epidinium и Ophryoscolex , тогда как метаногены, наиболее часто связанные с простейшими, относятся к порядкам Methanobacteriales и Methanobacteriales и [30].Анаэробные грибы, такие как Neocallimastix frontalis, , также были обнаружены во взаимосвязи с метаногенами, включая межвидовой перенос водорода, в результате чего ферментативная активность грибов увеличилась, а метаболизм сместился в сторону производства ацетата [42–44].

4. Стратегии снижения выбросов метана

Тема взаимоотношений метаногенов с другими микроорганизмами в рубце особенно важна при рассмотрении стратегий снижения выбросов метана.Снижение выбросов метана эффективно одним из двух способов: либо прямым воздействием на метаногены, либо косвенным эффектом, вызванным воздействием стратегии на доступность субстрата для метаногенеза, обычно посредством воздействия на другие микробы рубца. Оба подхода будут обсуждаться здесь с акцентом на стратегии, которые показали эффективность in vivo (см. Таблицу 1).


Стратегия борьбы с выбросами метана Механизм действий по борьбе с выбросами Соображения при выборе стратегии борьбы с выбросами


Крахмал Уменьшение компонентов клеточной стенки
Измельчение
Повышенная скорость прохождения; большая пропорция пропионата по сравнению с ацетатом; Пониженный pH рубца Сдвиг метаногенеза в задний кишечник или навоз, риск подострого ацидоза рубца (SARA)
Липиды
Жирные кислоты
Масла
179 Ингибирование талогена 9040 и простейшие; большая пропорция пропионата по сравнению с ацетатом; биогидрирование
Влияние на вкусовые качества, потребление, продуктивность и компоненты молока; варьируется в зависимости от диеты и вида жвачных животных; необходимы долгосрочные исследования. меньше водорода для метаногенеза Может произойти адаптация микробиоты; зависит от диеты; поддержание дефаунированных животных
Метаногеновая вакцина Иммунный ответ хозяина на метаногены Вакцина-мишень; различия в диете и географическом местоположении хозяина
Монензин Подавляет простейшие и грамположительные бактерии; отсутствие субстрата для метаногенеза Может произойти адаптация микробиоты; зависит от диеты и животного; запрещен в ЕС
Растительные соединения
Конденсированные танины
Сапонины
Эфирные масла
Противомикробная активность; снижение доступности водорода Оптимальная дозировка неизвестна; больше in vivo необходимо исследования; необходимы долгосрочные исследования; может повлиять на усвояемость; остатки неизвестны
Органические кислоты
Фумарат
Малат
Поглотитель водорода, большая пропорция пропионата по сравнению с ацетатом Зависит от диеты; больше in vivo необходимо исследования; необходимы долгосрочные исследования; может повлиять на усвояемость

4.1. Состав рациона

Компоненты корма, особенно тип углеводов, важны для производства метана, поскольку они способны влиять на pH рубца и впоследствии изменять присутствующую микробиоту [45]. Эллис и др. [11] смогли спрогнозировать производство метана у молочного и мясного скота на основе потребления сухого вещества, нейтрального детергентного волокна и содержания лигнина в рационе, измерения легко получить на фермах, с показателем 0,71. Усвояемость целлюлозы и гемицеллюлозы тесно связана с образованием метана, в большей степени, чем растворимых углеводов [46].В исследовании Холтера и Янга [46] была обнаружена положительная взаимосвязь между усвояемостью гемицеллюлозы и выходом метана у нелактирующих коров, получающих корм. Обнаружена отрицательная связь между усвояемостью целлюлозы и выходом метана [46]. Совант и Гигер-Ревердин [47] обнаружили, что зависимость между производством метана и долей концентрата в рационе является криволинейной, при этом потери метана в размере 6-7% валовой энергии (GE) являются постоянными при уровнях концентрата 30-40% в рационе. диета, а затем снижение до 2–3% ГЭ с долей концентрата 80–90%.Также известно, что крахмальный компонент рациона способствует образованию пропионата за счет перехода на амилолитические бактерии и снижения pH в рубце, что приводит к снижению метаногенеза [48]. Джонсон и Джонсон [45] заявили, что переваривание волокон клеточной стенки увеличивает производство метана за счет увеличения количества производимого ацетата по отношению к пропионату. Увеличение выхода метана связано с ферментацией ацетата, который обеспечивает метильную группу для метаногенеза [49]. Измельчение кормового корма перед его употреблением коровами также, по-видимому, снижает производство метана, предположительно за счет увеличения скорости переваривания и прохождения через желудочно-кишечный тракт, тем самым ограничивая время, доступное для производства метана в рубце [45].

Важно отметить, что увеличение количества быстро ферментируемых углеводов в рационе может увеличить скорость их прохождения из рубца, а также снизить pH рубца (см. Таблицу 1). Повышенная скорость прохождения может сдвинуть метаногенез в заднюю кишку, а также в навоз, что, возможно, приведет к снижению выбросов метана в рубце [50]. Кроме того, переваривание быстро ферментируемых углеводов в рубце может увеличить производство ЛЖК. Если выработка ЛЖК превышает абсорбцию, pH в рубце упадет, что приведет к подострому ацидозу рубца (SARA) и нарушению микробиоты рубца [51].

4.2. Липиды

Липиды, такие как жирные кислоты и масла, являются вариантами пищевых добавок, которые были исследованы как in vitro, , так и in vivo на предмет их влияния на метаногенез. Считается, что повышенное содержание липидов в корме снижает метаногенез за счет ингибирования простейших, увеличения производства пропионовой кислоты и «биогидрирования ненасыщенных жирных кислот» [45]. Ненасыщенные жирные кислоты могут использоваться в качестве акцепторов водорода в качестве альтернативы восстановлению диоксида углерода [45].Также считается, что жирные кислоты ингибируют метаногены напрямую через связывание с клеточной мембраной и прерывание мембранного транспорта [52]. Интересно, что Kong et al. [53] выявили архей с помощью флуоресценции in situ гибридизации (FISH) в рубце молочных коров с добавлением льняного семени и не обнаружили каких-либо очевидных различий в пропорции архей с добавлением льняного семени. Авторы заявили, что возможно добавление жирных кислот влияло на активность, а не на количество метаногенов.

Мета-анализ выхода метана с добавлением липидов у лактирующих молочных коров обнаружил снижение метана на 2,2% на 1% добавленных липидов в рационе [54]. В отношении крупного рогатого скота и овец Beauchemin et al. [55] обнаружили связь снижения метана на 5,6% на процентную единицу липидов, добавленных в рацион. Существует множество факторов, которые могут объяснить различное влияние липидов на снижение уровня метана, например, вид жвачных, экспериментальный рацион и тип используемого липида. Превосходный обзор экспериментов in vivo с использованием липидных добавок для исследования снижения выбросов метана можно найти у Martin et al.[6].

4.2.1. Жирные кислоты

Ряд жирных кислот был исследован in vivo на эффект подавления метана. Было обнаружено, что миристиновая кислота снижает содержание метана на 22% у овец, получавших корм на основе кормов, и на 58% при рационе на основе концентратов при использовании 50 мг / кг сухого вещества [56]. Odongo et al. [57] измерили снижение содержания метана на 36% у молочного скота, получавшего общий смешанный рацион с добавлением 5% миристиновой кислоты из расчета на сухое вещество (СВ). В исследованиях vitro было обнаружено, что жирные кислоты, используемые в комбинации, имеют наибольшее подавление метаногенеза из-за синергетического эффекта [52, 58].Следовательно, вполне вероятно, что добавление масел приведет к более резкому снижению выработки метана, чем отдельные жирные кислоты [58].

4.2.2. Масла

Масла, извлеченные из растительных источников, обычно содержат благоприятное количество жирных кислот со средней и длинной цепью [58, 59]. Рафинированное соевое масло, скармливаемое мясным быкам с содержанием 6%, снижает производство метана на 39% в литрах в день (л / день) [60]. Подсолнечное масло изучается чаще и приводит к снижению метаногенеза на 11,5–22,0% [59, 61].Подсолнечное масло также комбинируют с льняным маслом в соотношении 1: 3 и скармливают овцам на пастбищной диете в испытании «доза-эффект», но при включении 1,2–5% масла в пересчете на сухое вещество значительного снижения не наблюдалось. в метаногенезе [62]. Добавление льняного масла в дозу 5% СВ для лактирующих молочных коров привело к снижению количества метана в день на 55,8% [63]. Кокосовое масло является наиболее популярным маслом для экспериментов по снижению выбросов метана, и было обнаружено, что оно вызывает значительное сокращение метаногенеза, хотя степень снижения варьируется от 13 до 73%, в зависимости от уровня включения, рациона и используемых видов жвачных [60, 64, 65].Поскольку кокосовое масло имеет соотношение лауриновой и миристиновой кислот 2,6: 1,0, аналогично эффективным отношениям для снижения выбросов метана 4: 1, 3: 2 и 2,5: 2,5, обнаруженным в in vitro Soliva et al. [58], ожидается, что это масло обеспечит значительное снижение метаногенеза in vivo . Соотношение лауриновой и миристиновой кислот в пальмоядровом масле составляет 3: 1, что свидетельствует о большей эффективности в борьбе с выбросами метана по сравнению с кокосовым маслом, но, насколько нам известно, в настоящее время нет опубликованных отчетов о добавлении пальмоядрового масла in vivo. В исследовании in vitro , проведенном Dohme et al. [66], кокосовое масло снижает содержание метана на 21%, в то время как пальмоядровое масло снижает содержание метана на 34%, что дает больше доказательств того, что пальмоядровое масло может быть более эффективным. Однако важно отметить, что исследования in vivo с добавлением масел часто сопровождаются снижением потребления сухого вещества, что также может привести к снижению выработки метана [65].

4.2.3. Другие источники липидов

Другие источники липидов, такие как жир и семена, также были исследованы на предмет подавления метана.Beauchemin et al. [61] добавили телкам 34 г жира на 1 кг сухого вещества и обнаружили 11% снижение содержания метана на 1 кг сухого вещества. Jordan et al. [67] добавляли мясным быкам цельную сою с уровнем включения 27% сухого вещества и, несмотря на проблемы вкусовых качеств, приводящие к отказу до 60%, обнаружили снижение количества литров метана в день на 25%. Beauchemin et al. [61, 68] провели два эксперимента с использованием добавок семян подсолнечника к телкам и дойным коровам и обнаружили снижение метаногенеза на 23% и 10,4% соответственно.Beauchemin et al. [68] также добавляли дойным коровам семена льна и канолы в количестве 3,3% (на основе сухого вещества), и было обнаружено, что снижение содержания метана составило 17,8% и 16,0%, соответственно, в г / кг DMI [68]. Machmüller et al. [65] обнаружили снижение метана на килограмм живой массы при добавлении семян рапса, подсолнечника и льна на 19%, 27% и 10%, соответственно, при выращивании ягнят. Наконец, Grainger et al. [69] скармливали 2,61 кг (в пересчете на сухую массу) цельных семян хлопчатника лактирующим коровам и обнаружили, что среднее снижение метана за двенадцать недель эксперимента составило 2.9% на 1% добавления жира, снижение на 1,5% на третьей неделе и 4,4% на двенадцатой неделе.

Независимо от того, какая липидная форма используется для добавок, важно учитывать исследуемые виды жвачных животных и рацион, поскольку снижение уровня метана может варьироваться в зависимости от присутствующих компонентов корма (см. Таблицу 1) [6]. Кроме того, включение липидов может влиять на вкусовые качества, потребление, продуктивность животных и компоненты молока, и все это может иметь значение для практического использования на фермах [57, 67]. Наконец, большинство из экспериментов in vivo , проведенных для изучения липидов, поскольку стратегии снижения выбросов метана являются краткосрочными, что делает практически невозможным выводы о долгосрочных репрессивных эффектах.Следовательно, необходимо провести долгосрочные эксперименты с добавками, чтобы тщательно оценить эффективность липидных добавок в качестве стратегии борьбы с выбросами.

4.3. Defaunation Treatment

Defaunation Treatment

Defaunation Treatment (Удаление простейших из рубца) использовался для исследования роли простейших в функции рубца, а также для изучения влияния на выработку метана. Простейшие в рубце, как указывалось ранее, имеют симбиотические отношения с метаногенами, участвуя в межвидовом переносе водорода, который обеспечивает метаногены водородом, который им необходим для восстановления диоксида углерода до метана [70].Было подсчитано, что метаногены, связанные с простейшими инфузориями, как внутриклеточно, так и внеклеточно, ответственны за от 9 до 37% продукции метана в рубце [70–72]. По этой причине методы лечения, которые уменьшают популяцию простейших в рубце, могут также уменьшить популяцию метаногена, ассоциированного с простейшими, и, следовательно, снизить выработку метана в рубце. Используемые методы лечения включают сульфат меди, кислоты, поверхностно-активные химические вещества, триазин, липиды, дубильные вещества, ионофоры и сапонины [19].Было высказано предположение, что влияние дефаунации на выход метана зависит от диеты. Хегарти [73] обнаружил, что из-за дефауны выброс метана снижается на 13%, но степень снижения зависит от диеты. Наибольшее сокращение производства метана с дефаунацией было измерено на диете с высоким содержанием концентрата, вероятно, потому, что простейшие являются преобладающим источником водорода для метаногенеза в диетах на основе крахмала. Хотя, Hegarty et al. [74] также обнаружили, что не было никакого основного воздействия простейших на выработку метана в рубце, когда исследовали у ягнят, лишенных химии, дефонтированных от рождения и давних.Другое соображение — есть ли долгосрочные эффекты дефауны на метаногенез (см. Таблицу 1). Morgavi et al. [75] обнаружили, что сокращение метана из-за дефауна продолжается более двух лет, но исследование ионофорных добавок, проведенное Guan et al. [76] обнаружили, что сокращение метаногенеза в рубце было кратковременным, и предположили, что это было связано с адаптацией простейших инфузорий. Наконец, содержание животных, лишившихся жизни, может быть затруднено. Недавнее исследование показало, что передача жизнеспособных простейших обезвожившим животным не происходит легко через контакт с кормом или фекалиями фаунированных животных или при прямом контакте с фаунированными животными, а происходит через загрязненную воду [77].

4.4. Вакцина

Другая стратегия снижения метана, которая исследуется, — это разработка вакцины, которая будет стимулировать иммунную систему жвачных животных к выработке антител против метан-продуцирующих метаногенов [78]. В исследовании Райта и его коллег [78] были разработаны две вакцины, названные VF3 (на основе трех штаммов метаногена) и VF7 (на основе семи штаммов метаногена), которые обеспечивали снижение содержания метана на 7,7% на потребление сухого вещества, несмотря на то, что только приблизительно 20% населения метаногена является целевой.Та же исследовательская группа также создала вакцину на основе пяти штаммов метаногена, которую вводили в ходе трех вакцинаций овцам [79]. Хотя вакцина нацелена на 52% метаногенов, присутствующих в рубце овец, выход метана увеличился на 18% после вакцинации, что привело авторов к выводу, что вакцина не нацелена на метаногены, способные производить большую часть метана. Еще одним соображением при использовании вакцин против метаногенов является то, что присутствующая популяция метаногена в рубце может различаться в зависимости от диеты и географического положения хозяина, что затрудняет единый целевой подход [38].

Недавно была разработана дополнительная вакцина с использованием субклеточных фракций Methanobrevibacter ruminantium M1 [80]. Двадцать овец были вакцинированы и затем ревакцинированы через три недели, и было обнаружено, что антисыворотка вызывает агглютинацию метаногенов и снижает рост и продукцию метана in vitro . In vivo Тестирование эффективности вакцины в отношении метаногенов не проводилось (см. Таблицу 1).

4.5. Монензин

Монензин, антибиотик, продуцируемый Streptomyces cinnamonensis , продается в Северной Америке для повышения эффективности корма и увеличения веса, увеличения производства молока и уменьшения молочного жира [81].В последнее время возобновился интерес к монензину как к стратегии уменьшения образования метана, поскольку он, как известно, подавляет грамположительные микроорганизмы, ответственные за снабжение метаногенов субстратом для метаногенеза. Воздействие монензина на микробную клетку опосредуется его способностью препятствовать потоку ионов [82, 83]. Моненсин селектирует грамотрицательные микроорганизмы, что вызывает сдвиг в сторону производства пропионата в рубце [82, 83]. По этой причине предполагается, что монензин не влияет на выработку метана, ингибируя метаногены, но вместо этого подавляет рост бактерий и простейших, обеспечивая субстрат для метаногенеза [82–85].Это утверждение подкрепляется тем фактом, что когда в рубцовую жидкость вводили монензин in vitro , выработка метана снижалась до тех пор, пока не поступил водород, после чего производство метана возобновилось [83].

Снижение метаногенеза после приема ионофоров варьируется от незначительного до 25%, с разными исходами для продолжительности этих эффектов [45]. В исследовании, разработанном для измерения выхода метана у лактирующих молочных коров, получавших добавку монензина, коров кормили кормом с добавлением монензина в течение 3 недель после переходного периода, кормили рационом без монензина в течение 5 месяцев, а затем кормили кормом с добавлением монензина в течение следующего периода. 3 недели [81].Было обнаружено, что хотя во время первой обработки монензином коровы снизили потребление корма, увеличили выработку пропионата и снизили выход метана, вторая обработка монензином не вызвала ранее наблюдаемых эффектов. В этом исследовании лечения и на животных были противоречия, но авторы заявили, что адаптация микрофлоры рубца к монензину могла произойти во время первого лечения, подавляя действие препарата во время второго лечения.

Guan et al.[76] исследовали использование монензина у бычков и влияние добавок на выброс метана. Бычков кормили либо рационом с низким содержанием концентратов, либо рационом с высоким содержанием концентратов с добавлением монензина. Для низкоконцентрированной диеты первоначальное снижение выхода метана, измеренное с помощью индикаторного газа гексафторида серы (SF 6 ), было обнаружено на 27% в течение первых четырех недель, в сочетании с сокращением популяции инфузорий простейших. 77% [76]. В случае высококонцентрированной диеты в течение первых двух недель наблюдалось снижение выхода метана на 30% и сокращение популяции простейших инфузорий на 83% [76].Уровни метана вернулись к исходному уровню, а количество простейших вернулось к исходному уровню через шесть и четыре недели, соответственно. Авторы пришли к выводу, что влияние монензина на уровни метана в рубце связано с популяцией простейших инфузорий, и, когда эта популяция адаптировалась к монензину, уровни метана в рубце вернулись к уровням до лечения.

Совсем недавно было исследовано длительное введение монензина на лактирующих молочных коровах, получавших общий смешанный рацион дойной коровы [86].Двадцать четыре коровы скармливались парами, и были измерены исходные показатели выхода метана. Добавка монензина была включена в рацион половины парных животных, в то время как другая половина получала ту же диету без монензина, и выход метана измерялся для каждой пары ежемесячно в течение шести месяцев. Было обнаружено, что обработка монензином вызывает снижение выхода метана на 7–9% по сравнению с контрольными коровами, и это снижение сохраняется в течение всего периода лечения без какой-либо адаптации [86]. В связи с этим экспериментом были получены образцы рубца для молекулярного анализа изменений в популяции метаногена при добавлении монензина [87].Не было обнаружено значительных различий в количестве или разнообразии метаногенов, что подтверждает, что монензин способен подавлять метаногенез посредством косвенного воздействия на метаногены.

Таким образом, хотя было показано, что добавка монензина эффективно снижает выход метана у жвачных животных, есть несколько факторов, которые могут повлиять на эффективность (см. Таблицу 1). Во-первых, по-видимому, существуют различия в степени уменьшения загрязнения в зависимости от диеты и используемого животного [76, 86]. Кроме того, популяция инфузорий в рубце может повлиять на результат приема добавок, при этом возможна адаптация [76].Наконец, монензин был запрещен в Европейском Союзе, поэтому в этих странах потребуется альтернативный метод снижения выбросов метана.

4.6. Растительные соединения

Три основных растительных соединения, эффективных для снижения выбросов метана in vitro , — это конденсированные танины, сапонины и эфирные масла. In vivo эффективность этих соединений варьируется с точки зрения снижения уровня метана.

Считается, что конденсированные танины напрямую ингибируют метаногены, а также косвенно ограничивают метаногенез за счет снижения доступности водорода [88]. Lespedeza cuneata , содержащий конденсированный танин, скармливали козам ad libitum , и было обнаружено, что он снижает содержание метана на 57% в пересчете на г / кг DMI по сравнению с козами, получавшими смесь Digitaria ischaemum и Festuca arundinacea [89] . Было обнаружено, что у овец, потребляющих 41 г танинсодержащего вещества Acacia mearnsii на 1 кг сухого вещества, наблюдается снижение метаногенеза на 13% [90]. Содержащие танин Callinada calothyrsus и Fleminga macrophylla также снижали содержание метана в организме ягнят на 24% [91], но экстракт конденсированного танина из Schinopsis quebrachocolorado [92] и силос из сорго, содержащий танин, при скармливании крупного рогатого скота не снижали содержания метана [93]. не подавляют метаногенез.

Было показано, что сапонины in vitro ингибируют простейшие, а также ограничивают доступность водорода для метаногенеза [94]. Недавнее исследование Holtshausen et al. [95] добавляли коровам порошок цельного растения Yucca schidigera в концентрации 10 г / кг сухого вещества или порошок цельного растения Quillaja saponaria в концентрации 10 г / кг сухого вещества, оба из которых содержали сапонин. Авторы заявили, что предыдущие исследования in vitro обнаружили снижение метана при более высоких уровнях включения (15 г / кг сухого вещества и выше), но этих высоких уровней избегали in vivo , чтобы минимизировать влияние на усвояемость [94].Никакого эффекта от растительной добавки не было обнаружено in vivo , и авторы пришли к выводу, что снижение метана in vitro было, вероятно, связано с уменьшением переваривания корма и ферментации [95]. Это затрудняет добавление in vivo , потому что для измерения снижения выхода метана могут потребоваться более высокие уровни кормления, но это снижение будет связано с ухудшением усвояемости корма.

Эфирные масла обладают антимикробным действием, которые действуют аналогично монензину, подавляя грамположительные бактерии [96, 97].Таким образом, эфирные масла могут уменьшить количество водорода, доступного для метаногенеза. Было проведено несколько исследований in vivo, , но одно исследование Beauchemin и McGinn [98], в котором телок давали 1 г / день эфирного масла и экстракта специй, не обнаружило влияния на выработку метана и отрицательное влияние на усвояемость корма.

Очевидно, что необходимы дополнительные исследования in vivo с эфирными маслами, а также конденсированными танинами и сапонинами, чтобы определить оптимальную дозировку, при которой метаногенез снижается без побочных эффектов на усвояемость (см. Таблицу 1).Кроме того, необходимы долгосрочные исследования, чтобы определить, способны ли микробы адаптироваться к добавкам и возобновить метаногенез на исходном уровне. Наконец, важно изучить, появляются ли какие-либо остатки добавок в молоке или мясе, чтобы сделать это жизнеспособным вариантом снижения выбросов метана у производственных животных [97].

4,7. Органические кислоты

In vivo Влияние добавок органических кислот на сокращение выбросов метана различно. Вуд и его коллеги [99] добавили 100 г / кг фумаровой кислоты в свободной или инкапсулированной форме к растущим ягнятам и обнаружили снижение выхода метана на 62% и 76% соответственно.Фумаровую кислоту также скармливали растущему мясному скоту в дозе 175 г / день, бычкам в количестве 80 г / день и молоднякам в дозе 4–10 г / 100 г (на основе сухого вещества), но не было обнаружено значительного снижения выбросов метана, хотя подавление DMI был обнаружен на более высоких уровнях включения [59, 100]. К говяжьим телкам добавляли 3,75% и 7,5% яблочной кислоты в пересчете на сухое вещество, и было измерено снижение выхода метана на 3% и 9% в г / кг DMI, соответственно [101]. Авторы заявили, что влияние добавок органических кислот на снижение уровня метана, по-видимому, зависит от диеты, с большим снижением при использовании рационов с высоким содержанием концентратов.Это связано с большим влиянием на соотношение ацетат-пропионат в рубце, в дополнение к его способности действовать как поглотитель водорода [101]. Основываясь на представленных здесь исследованиях in vivo и , представляется, что органические кислоты могут оказывать положительное воздействие с точки зрения снижения выбросов метана, но необходимо провести дополнительные экспериментов in vivo , чтобы определить оптимальные условия для использования (см. Таблицу 1). Кроме того, необходимо провести долгосрочные исследования добавок, чтобы подтвердить, что любые наблюдаемые преимущества сохраняются.

5. Резюме

Более двух десятилетий исследователи работали над выявлением, количественной оценкой и подавлением метаногенов и метаногенеза с помощью различных стратегий снижения выбросов метана. Несмотря на то, что в ходе этих экспериментов был почерпнут большой объем информации, включая идентификацию ряда штаммов метаногена в рубцах крупного рогатого скота и овец по всему миру, а также стратегии смягчения последствий с различной степенью осуществимости и эффективности, исследования все еще проводятся. что будет сделано в этой области.Кроме того, многие стратегии снижения выбросов метана работают через косвенное воздействие на метаногены, ограничивая доступность субстрата для метаногенеза. Прямое воздействие на метаногены может привести к большему снижению метаногенеза, а также к более устойчивому сокращению, что делает такие стратегии, как использование вакцин и пищевых жирных кислот, которые ингибируют метаногены и простейшие, особенно многообещающими.

Благодарность

Авторы выражают признательность за финансирование, предоставленное Советом естественных и технических исследований Канады (BWM & SEH).

Реакция образования метана посредством окисления пропионата на карбоксилированные многослойные углеродные нанотрубки при обогащении рисовой почвы [PeerJ]

MWCNTs-COOH и повреждение клеток

Сообщалось, что

MWCNT оказывают различное ингибирующее действие на микроорганизмы (Kang, Mauter & Elimelech, 2008; Yadav, Mungray & Mungray, 2016). Предыдущие исследования с помощью SEM показали, что клетки, обработанные CNT, теряли свою клеточную целостность (уплощались или деформировались) (Kang, Mauter & Elimelech, 2008).Антимикробный механизм, вероятно, включает окислительный стресс и повреждение клеточной мембраны (Du et al., 2013). Кроме того, результаты Kang et al. (2007) предположили, что физическое взаимодействие УНТ с бактериальными клетками, а не окислительный стресс, является основным механизмом уничтожения. В противном случае антимикробная активность УНТ регулировалась их концентрацией (Das et al., 2014). В текущем исследовании применялась относительно высокая концентрация MWCNTs-COOH (1 г / л) по сравнению с предыдущими исследованиями ингибирующих эффектов (Nouara et al., 2013; Wang et al., 2014). Если бы тормозные механизмы сработали, в настоящем эксперименте можно было бы ожидать более серьезных эффектов. Однако в этом исследовании мы не наблюдали побочных эффектов. Вместо этого эффекты MWCNTs-COOH на продукцию CH 4 в результате разложения пропионата были положительными при наших обогащениях, аналогично эффектам Fe 3 O 4 . Кроме того, ускорение образования CH 4 было выше при максимальной испытанной концентрации MWCNT (рис.1). Наблюдения FISH показали, что бактериальные и архейные клетки были агрегированы независимо от лечения (рис. 2). Изображения SEM дополнительно подтвердили образование агрегатов клетка-MWCNTs при обработке MWCNT и показали, что клетки находились в прямом контакте с MWCNTs (рис. 3). Согласно нашим наблюдениям с помощью SEM, проникновения в клеточные мембраны или неблагоприятного воздействия на целостность клетки не произошло.

Отсутствие ингибирующего эффекта в настоящем эксперименте, вероятно, было связано с анаэробными условиями.Окислительный стресс от MWCNTs является результатом производства активных форм кислорода (ROS) из-за небольшого размера и высокой реакционной способности MWCNTs (Du et al., 2013). Также было показано, что MWCNTs-COOH могут генерировать заметные количества АФК во время облучения УФА с интенсивностью, аналогичной интенсивности солнечного света (Qu, Alvarez & Li, 2013). Однако в настоящем эксперименте обогащающее культивирование проводили в темноте и в анаэробных условиях. Таким образом, окислительный стресс не должен быть важным фактором в этом исследовании.Кроме того, цитотоксичность УНТ часто связывают с физико-химическими свойствами УНТ. Считается, что карбоксилатная функционализация MWCNT делает наноматериалы более биосовместимыми, чем исходные MWCNT, благодаря их улучшенной гидрофильности и дисперсии в биологических средах (Vardharajula et al., 2012). УНТ, используемые в этом исследовании, представляют собой карбоксилированные МУНТ.

MWCNTs-COOH и микробное сообщество в синтрофных консорциумах

Вместо ингибирования добавление MWCNTs-COOH существенно облегчило синтрофическое производство CH 4 в результате окисления пропионата.О стимуляции выработки CH 4 в присутствии Fe 3 O 4 сообщалось ранее (Kato, Hashimoto & Watanabe, 2012; Li et al., 2015; Liu et al., 2015; Rotaru et al. , 2014a; Viggi et al., 2014; Zhang & Lu, 2016). Все существующие отчеты предполагают, что Fe 3 O 4 действует как проводник, который облегчает или ускоряет перенос электронов между Geobacter и ацетотрофными метаногенами ( Methanosarcina и Methanosaeta ).Виды Geobacter широко распространены в бескислородных почвах и обычно осуществляют диссимиляционное восстановление внеклеточных акцепторов электронов, таких как Fe (III), в сочетании с окислением ацетата и других доноров электронов (Mahadevan, Palsson & Lovley, 2011; Richter, Schicklberger И Гешер, 2012). Предыдущие исследования показали, что Geobacter может участвовать в синтрофическом окислении пропионата в рисовой почве в метаногенных условиях с помощью зондирования стабильных изотопов (Gan et al., 2012; Lueders, Pommerenke & Friedrich, 2004). Микробные механизмы DIET между Geobacter и метаногенами были тщательно изучены (Holmes et al., 2017; Liu et al., 2012; Morita et al., 2011; Rotaru et al., 2014a; Rotaru et al., 2014b). . Электрические соединения, поддерживающие DIET-емкость Geobacter , включают электропроводящие пили (э-пили) и цитохромы. Присутствие видов Geobacter часто приравнивается к появлению и способности к DIET (Holmes et al., 2017). По сравнению с CK-2 относительная численность Geobacter увеличивалась в присутствии MWCNTs-COOH и составляла 14% бактериального сообщества (рис. 4). Кроме того, Methanosarcina был сильно обогащен присутствием MWCNTs-COOH. Предыдущие исследования также показали, что обилие видов Geobacter , а также проводящие материалы одновременно усиливают рост Geobacter и продукцию CH 4 в метаногенных почвах (Kato, Hashimoto & Watanabe, 2012; Li et al. ., 2015; Ротару и др., 2015). Из-за высокой электропроводности MWCNTs-COOH кажется, что MWCNTs-COOH имеют аналогичную функцию с Fe 3 O 4 , чтобы облегчить DIET в синтрофном метаногенезе из пропионата. Однако в этом исследовании у нас не было достаточных доказательств, подтверждающих наличие DIET в синтрофных консорциумах от окисления пропионата. В частности, исследование Salvador et al. (2017) предположили, что УНТ значительно ускоряют производство CH 4 непосредственно чистыми метаногенами и что прямой эффект не зависит от возможных механизмов, таких как DIET.Убедительные механизмы для моделирования производства CH 4 в результате окисления пропионата до сих пор неизвестны. Выяснение механизмов, которые увеличивают производство CH 4 , потребует гораздо более обширных исследований с новыми подходами в будущей работе.

Недавние исследования показали, что УНТ могут также стимулировать выработку CH 4 в озерных отложениях с окислением бутирата, анаэробными реакторами с перевариванием свекольного сахара и чистыми культурами метаногенов (Ambuchi et al., 2017; Сальвадор и др., 2017; Чжан и Лу, 2016). Однако о влиянии MWCNT-COOH на синтрофные консорциумы от окисления пропионата при обогащении рисовой почвы никогда не сообщалось. Наше исследование подтвердило, что MWCNTs-COOH могут изменять относительную численность доминирующих родов бактерий и архей при обогащении рисовой почвы (рис. 4). Smithella использует пропионат нерандомизирующим путем, при котором пропионат сначала расщепляется до ацетата и бутирата, а затем разлагается посредством β-окисления, в то время как Syntrophomonas являются известными разложителями бутирата (Dolfing, 2013; Gan et al., 2012; Lueders, Pommerenke & Friedrich, 2004). Отмечено увеличение относительной численности бактериальных родов, таких как Geobacter , Smithella , Syntrophomonas и родов архей, таких как Methanosarcina , в обработке MWCNTs-COOH . Однако существенных различий в составе бактериального и архейного сообществ во время обогащения не наблюдалось. Недавние исследования также показали, что структура сообщества микробов значительно изменилась после добавления УНТ (Ambuchi et al., 2017; Шреста и др., 2013; Чжан и Лу, 2016). Например, бактериальные роды, такие как Rhodococcus , Cellulomonas и Nocardioides , увеличились после добавления 1 г / кг MWCNT в супесчаную почву (Shrestha et al., 2013). Кроме того, грибковые роды Pseudeurotium и Penicillium (важные в биогеохимическом круговороте углерода и фосфора в почве) были уменьшены после добавления 0,5 г / кг УНТ в травяную почву (Rodrigues, Jaisi & Elimelech, 2013).

К 2011 году мировое производство УНТ подскочило примерно до 4,6 килотонн в год (De Volder et al., 2013). Поскольку они все чаще используются в потребительских товарах, существует вероятность попадания УНТ в окружающую среду как в результате случайного выброса, так и преднамеренного применения. Возможные механизмы высвобождения УНТ во время жизненного цикла УНТ / полимера включают биодеградацию, промывку, диффузию, разрушение матрицы и сжигание (Petersen et al., 2011). Хотя многие предыдущие исследования были сосредоточены на токсичности этих материалов для микроорганизмов и здоровья человека, наше исследование побуждает к дальнейшим исследованиям для оценки различных последствий выброса наноматериалов в бескислородную природную среду.

Синтрофная пропионат-окисляющая микрофлора и ее биоаугментация при анаэробной очистке сточных вод для увеличения производства метана и удаления ХПК

  • 1.

    Гунасилан В. Н. Анаэробное сбраживание биомассы для производства метана: обзор. Биомасса и биоэнергетика, 1997, 13 (1): 83–114

    CAS Статья Google ученый

  • 2.

    Gou M, Zeng J, Wang H Z, Tang Y Q, Shigematsu T, Morimura S, Kida K.Структура и динамика микробного сообщества хемостатов, потребляющих крахмал и глюкозу, в течение двух лет непрерывной работы. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2016, 10 (2): 368–380

    CAS Статья Google ученый

  • 3.

    Нильсен Х. Б., Уеллендаль Х., Аринг Б. К. Регулирование и оптимизация процесса биогаза: пропионат как ключевой параметр. Биомасса и биоэнергетика, 2007, 31 (11): 820–830

    CAS Статья Google ученый

  • 4.

    Бхуниа П., Гангрекар М. М. Статистическое моделирование и оптимизация грануляции биомассы и удаления ХПК в реакторах UASB, обрабатывающих сточные воды низкой прочности. Технология биоресурсов, 2008, 99 (10): 4229–4238

    CAS Статья Google ученый

  • 5.

    Фэн Дж., Ван И Л, Цзи Х И, Юань Д. Кью, Ли Х. Производительность и рост биочастиц анаэробного реактора с перегородкой (ABR), в который поступают бытовые сточные воды низкой прочности. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2015, 9 (2): 352–364

    CAS. Статья Google ученый

  • 6.

    Озтюрк М. Превращение ацетата, пропионата и бутирата в метан в термофильных условиях в реакторах периодического действия. Water Research, 1991, 25 (12): 1509–1513

    Статья Google ученый

  • 7.

    Ланге М., Аринг Б. К. Комплексное исследование молекулярной методологии и молекулярной биологии метаногенных архей. FEMS Microbiology Reviews, 2001, 25 (5): 553–571

    CAS. Статья Google ученый

  • 8.

    Раджи Х., Пуйоль Д., Мартинес М. К., Диас Е. Е., Санс Дж. Л. Вакуум способствует метаболическим сдвигам и увеличивает производство биогенного водорода в системах темной ферментации. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2016, 10 (3): 513–521

    CAS. Статья Google ученый

  • 9.

    Штамс А. Дж., Плагж С. М., Мирна М. С. Перенос электронов в синтрофных сообществах анаэробных бактерий и архей. Обзоры природы. Микробиология, 2009, 7 (8): 568–577

    CAS. Статья Google ученый

  • 10.

    Worm P, Stams A.JM, Cheng X, Plugge C.M. Зависимая от роста и субстрата транскрипция генов, кодирующих формиатдегидрогеназу и гидрогеназу, в Syntrophobacter fumaroxidans и Methanospirillum hungatei . Микробиология, 2011, 157 (1): 280–289

    CAS. Статья Google ученый

  • 11.

    Zheng G, Li J, Zhao F, Zhang L, Wei L, Ban Q, Zhao Y. Влияние освещения на способность анаэробного активного ила к производству водорода.Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2012, 6 (1): 125–130

    CAS Статья Google ученый

  • 12.

    Дэниэл С. Л., Кейт Е. С., Ян Х, Лин И. С., Дрейк Х. Л. Использование метоксилированных ароматических соединений ацетогеном. Clostridium thermoaceticum : экспрессия и специфичность зависимой одеметилирующей активности. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях, 1991, 180 (1): 416–422

    CAS Статья Google ученый

  • 13.

    Ван Л., Чжоу К., Ли Ф. Т. Предотвращение накопления пропионовой кислоты в анаэробном процессе производства биогидрогена. Биомасса и биоэнергетика, 2006, 30 (2): 177–182

    CAS Статья Google ученый

  • 14.

    Галлерт С., Винтер Дж. Накопление и разложение пропионовой кислоты во время перезапуска полномасштабного анаэробного варочного котла для биологических отходов. Технология биоресурсов, 2008, 99 (1): 170–178

    CAS Статья Google ученый

  • 15.

    Мохан С. В., Рао Н. К., Прасад К. К., Сарма П. Н. Биоаугментация анаэробного секвенирующего биопленочного реактора периодического действия (AnSBBR) с иммобилизованными сульфатредуцирующими бактериями (SRB) для очистки сульфатсодержащих химических сточных вод. Биохимия процессов, 2005, 40 (8): 2849–2857

    CAS Статья Google ученый

  • 16.

    Мароне А., Массини Дж., Патриарка С., Синьорини А., Варроне С., Иззо Г. Производство водорода из растительных отходов путем биоаугментации местных ферментативных сообществ.Международный журнал водородной энергетики, 2012 г., 37 (7): 5612–5622

    CAS Статья Google ученый

  • 17.

    МакИнерни М. Дж., Брайант М. П. Анаэробная деградация лактата синтрофными ассоциациями Methanosarcina barkeri и Desulfovibrio видов и влияние H 2 на разложение ацетата. Прикладная и экологическая микробиология, 1981, 41 (2): 346–354

    CAS Google ученый

  • 18.

    Де Бок Ф. А. М., Плугге С. М., Стамс А. Дж. М. Межвидовой перенос электронов в консорциумах, разрушающих метаногенный пропионат. Water Research, 2004, 38 (6): 1368–1375

    Статья Google ученый

  • 19.

    Фридрих М., Спрингер Н., Людвиг В., Шинк Б. Филогенетические положения Desulfofustis glycolicus gen. nov., sp. nov. и Syntrophobotulus glycolicus gen. nov., sp. nov., два новых строгих анаэроба, растущих с гликолевой кислотой.Международный журнал систематической бактериологии, 1996, 46 (4): 1065–1069

    CAS Статья Google ученый

  • 20.

    Секигучи Ю., Камагата Ю., Накамура К., Охаши А., Харада Х. Syntrophothermus lipocalidus gen. nov., sp. nov., новый термофильный, синтрофный анаэроб, окисляющий жирные кислоты, который использует изобутират. Международный журнал систематической и эволюционной микробиологии, 2000, 50 (Pt 2): 771–779

    CAS Статья Google ученый

  • 21.

    Брунс А., Ципионка Х., Оверманн Дж. Циклический АМФ и ацилгомосериновые лактоны повышают эффективность культивирования гетеротрофных бактерий из центральной части Балтийского моря. Прикладная и экологическая микробиология, 2002, 68 (8): 3978–3987

    CAS Статья Google ученый

  • 22.

    Шенборн Л., Йетс П.С., Гринтон Б.Е., Гугенгольц П., Янссен П. Х. Жидкие серийные разведения уступают твердым средам для выделения культур, представляющих разнообразие почвенных бактерий на уровне филумов.Прикладная и экологическая микробиология, 2004 г., 70 (7): 4363–4366

    CAS Статья Google ученый

  • 23.

    Мартинс М., Фалейро М. Л., Баррос Р. Дж., Вериссимо А. Р., Баррейрос М. А., Коста М. С. Исследование характеристик и активности сульфатредуцирующих бактерий с высокой устойчивостью к тяжелым металлам для использования при дезактивации кислотных шахтных дренажей. Журнал опасных материалов, 2009 г., 166 (2–3): 706–713

    CAS Статья Google ученый

  • 24.

    Marchaim U, Krause C. Соотношение пропионовой и уксусной кислот при перегрузке анаэробного сбраживания. Технология биоресурсов, 1993, 43 (3): 195–203

    CAS Статья Google ученый

  • 25.

    Аринг Б. К., Сандберг М., Ангелидаки И. Летучие жирные кислоты как индикаторы несбалансированности процесса в анаэробных дигесторах. Прикладная микробиология и биотехнология, 1995, 43 (3): 559–565

    CAS Статья Google ученый

  • 26.

    Ван Лиер Дж. Б., Мартин Дж. Л. С., Леттинга Г. Влияние температуры на анаэробное термофильное преобразование летучих жирных кислот диспергированным и гранулированным илом. Water Research, 1996, 30 (1): 199–207

    Статья Google ученый

  • 27.

    Лю Р. Р., Тиан Кью, Ян Б., Чен Дж. Х. Гибридный анаэробный реактор с перегородкой для очистки сточных вод, подвергшихся удалению очистки. Международный журнал экологических наук и технологий, 2010 г., 7 (1): 111–118

    CAS Статья Google ученый

  • 28.

    Zhu G F, Li J Z, Wu P, Jin H Z, Wang Z. Рабочие характеристики и характеристики разделения фаз анаэробного реактора с перегородками для обработки сточных вод от переработки соевого белка. Технология биоресурсов, 2008, 99 (17): 8027–8033

    CAS Статья Google ученый

  • 29.

    Altaf M, Naveena B, Venkateshwar M, Kumar EV, Reddy G. Одностадийная ферментация крахмала до L (+) молочной кислоты с помощью Lactobacillus amylophilus GV6 в SSF с использованием недорогих источников азота для замены пептона и дрожжей extract – оптимизация с помощью RSM.Биохимия процессов, 2006, 41 (2): 465–472

    CAS Статья Google ученый

  • 30.

    Turki S, Kraeim I. B, Weeckers F, Thonart P, Kallel H. Выделение биоактивных пептидов из триптона, которые модулируют выработку липазы в Yarrowia lipolytica . Биохимия процессов, 2006, 41 (2): 465–472

    Статья Google ученый

  • 31.

    Federation W E.Американская ассоциация общественного здравоохранения. Стандартные методы исследования воды и сточных вод. Американская ассоциация общественного здравоохранения (APHA): Вашингтон, округ Колумбия, США, 2005

    Google ученый

  • 32.

    Дюбуа М., Жиль К. А., Гамильтон Дж. К., Реберс П., Смит Ф. Колориметрический метод определения сахаров и родственных веществ. Аналитическая химия, 1956, 28 (3): 350–356

    CAS. Статья Google ученый

  • 33.

    Li J, Zheng G, He J, Chang S, Qin Z. Способность анаэробного активного ила к образованию водорода при трех типах ферментации в реакторе непрерывного действия с мешалкой. Успехи биотехнологии, 2009, 27 (5): 573–577

    CAS Статья Google ученый

  • 34.

    Калия А., Ротанг А., Чопра П. Метод экстракции высококачественной и большого количества геномной ДНК, обычно применимый к патогенным бактериям. Аналитическая биохимия, 1999, 275 (1): 1–5

    CAS. Статья Google ученый

  • 35.

    Angelidaki I, Alves M, Bolzonella D, Borzacconi L, Campos JL, Guwy AJ, Kalyuzhnyi S, Jenicek P, van Lier J B. Определение биометанового потенциала (BMP) твердых органических отходов и энергетических культур: предлагаемый протокол для партии анализы. Наука о воде и технологиях, 2009 г., 59 (5): 927–934

    CAS Статья Google ученый

  • 36.

    Pullammanappallil P C, Chynoweth D. P, Lyberatos G, Svoronos S. A. Стабильная работа анаэробного сбраживания в присутствии высокой концентрации пропионовой кислоты.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *